Analysis of Ventral Furrow Formation in the Drosophila Embryo using Developmental Genetics in Combination with Computational Modelling

Abstract

This work explores cell biological mechanisms of ventral furrow formation during gastrulation of the fruit fly embryo (Drosophila melanogaster). During ventral furrow formation a band of cells in the ventral epithelium undergoes apical constriction (i.e. cells reduce their apical surface area) and forms a shallow indentation in the epithelium (the ventral furrow). Subsequently, this band of cells is invaginated into the interior of the embryo constituting the anlage of the mesoderm. Ventral furrow formation serves as a premier model system to study large-scale tissue movements in development as it is amenable to genetic manipulation and easily accessible to microscopic analysis. In the first part of this work, we show that two genes – dizzy (dzy) and rap1 – are critical to allow the proper formation of the furrow. Analyzing live-recordings of ventral furrow formation via automatic cell-tracking, we find that maternal loss of Dzy results in delayed apical constriction of ventral cells while maternal loss of Rap1 largely abolishes apical constriction. This causes ventral furrow formation to slow down or to fail, respectively. In both cases the actomyosin is unaffected but the establishment of apical adherens junctions is compromised: Upon loss of Dzy this apical junction establishment is slowed down, upon loss of Rap1 it only occurs fragmentarily with a conspicuous fraction of DE-cadherin being mislocalized to the cytoplasm. Overexpression of Dzy or Rap1 after invagination of the furrow interferes with the formation of the mesodermal monolayer as mesodermal cells clump and do not fully spread apart, correlating with the failure to reduce junction levels in the membranes. Together, these results point to a pivotal role of Dzy and Rap1 in the establishment and possibly the maintenance of adherens junctions during gastrulation. In the second part of this work we undertake a modelling approach to assist the analysis of ventral furrow formation via computer simulation. We model the epithelium as a sheet of hexagonal cells in a 2D surface view and equip the cells with biophysical properties, such as elasticity and contractility. The model shows that a lateral-to-ventral gradient of increasing cell contractility in the epithelium is a critical requirement to reproduce the morphology of the ventral furrow. The notion of such a gradient is supported in vivo by tracking labelled myosin in live-recordings. Based on combined analysis of in silico and in vivo data we challenge a previous view on ventral furrow formation as we do not find evidence for a cytoskeletal "ratchet"-mechanism by which cells would actively stabilize their constricted state between contraction pulses. We prefer to describe ventral furrow formation as a stochastic process where cells execute autonomous stochastic actomyosin contractions, under the constraint of their elasticity as well as their mechanical coherence in the epithelium. With this stochastic concept being in good congruence to experimental data, we show that ventral furrow formation can occur with less regulatory complexity than previously postulated.

Diese Arbeit untersucht zellbiologische Mechanismen der Ventralfurchenbildung während der Gastrulation des Embryos der Taufliege (Drosophila melanogaster). Im Zuge der Ventralfurchenbildung macht ein Band von Zellen entlang des ventralen Epithels apikale Konstriktion (d.h. die Zellen verkleinern ihre apikale Oberfläche) und bildet eine flache Einbuchtung im Epithel (die Ventralfurche). Anschließend wird dieses Zellband in das Innere des Embryos invaginiert und bildet die Anlage des Mesoderms. Die Ventralfurchenbildung dient als hervorragendes Modelsystem, um groß angelegte Gewebeumlagerungen während der Embryonalentwicklung zu studieren, da sie der genetischen Manipulation zugänglich ist und leicht mikroskopisch untersucht werden kann. Im ersten Teil dieser Arbeit zeigen wir, dass die zwei Gene dizzy (dzy) und rap1 essentiell sind, um eine reguläre Ventralfurchenbildung zu gewährleisten. Durch Analyse von Live-Aufnahmen der Ventralfurchenbildung mittels automatischen Zell-Trackings zeigt sich, dass das maternale Fehlen von Dzy zur verspäteten apikalen Konstriktion ventraler Zellen führt, während das maternale Fehlen von Rap1 apikale Konstriktion größtenteils unterbindet. Als Folge davon bildet sich die Ventralfurche verlangsamt bzw. überhaupt nicht. In beiden Fällen ist das Aktomyosin nicht betroffen, jedoch ist der Aufbau apikaler Adhäsionskontakte beeinträchtigt: Beim Fehlen von Dzy findet dieser Aufbau verlangsamt statt, beim Fehlen von Rap1 vollzieht er sich nur fragmentarisch, wobei ein auffallender Anteil von DE-Cadherin im Cytoplasma mislokalisiert ist. Überexpression von Dzy oder Rap1 nach Invagination der Furche behindert die Bildung des mesodermalen Monolayers, da mesodermale Zellen zusammenklumpen und sich nicht vollständig voneinander lösen, in Korrelation mit dem nicht stattfindenden Abbau von Adhäsionskontakten in den Membranen. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf eine entscheidende Rolle von Dzy und Rap1 beim Aufbau und möglicherweise der Erhaltung von Adhäsionskontakten während der Gastrulation. Im zweiten Teil dieser Arbeit verfolgen wir einen Modellierungs-Ansatz, um die Analyse der Ventralfurchenbildung per Computersimulation zu unterstützen. Wir modellieren das Epithel als eine Schicht hexagonaler Zellen in einer 2D-Oberflächen-Ansicht und geben den Zellen bio-physikalische Eigenschaften wie Elastizität und Kontraktilität. Das Modell zeigt, dass ein Gradient ansteigender Kontraktilität von lateral nach ventral im Epithel vorhanden sein muss, um die Morphologie der Ventralfurche zu reproduzieren. Die Hypothese eines solchen Gradienten wird in vivo gestützt durch die Betrachtung von markiertem Myosin in Live-Aufnahmen. Basierend auf der kombinierten Analyse von in silico- und in vivo-Daten bezweifeln wir eine bestehende Hypothese zur Ventralfurchenbildung, da wir keine Hinweise für einen "Ratschen"-Mechanismus des Cytoskeletts finden, demzufolge Zellen ihren unvollständig konstringierten Apex zwischen zwei Kontraktionspulsen aktiv stabilisieren. Wir ziehen es vor, die Ventralfurchenbildung als stochastischen Prozess aufzufassen, bei dem Zellen autonome stochastische Aktomyosin-Kontraktionen ausführen, unter der Einschränkung durch ihre eigene Elastizität sowie den mechanischen Zusammenhalt im Epithel. Da diese stochastische Auffassung gut mit experimentellen Daten in Einklang steht, zeigen wir, dass die Ventralfurchenbildung mit weniger regulatorischer Komplexität als zuvor postuliert ablaufen kann.