Ein vergrößerndes Transfersystem für ein Cs-korrigiertes Phasenkontrast-Transmissions-Elektronenmikroskop

Abstract

Dünne biologische Proben, die überwiegend aus Elementen mit niedriger Ordnungszahl bestehen, können als schwache Phasenobjekte beschrieben werden. In der konventionellen Transmissionselektronenmikroskopie (CTEM) wird Phasenkontrast durch Defokussierung des Objektivs erreicht. Diese Defokus-Einstellung führt zu starken Oszillationen der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) bei hohen Raumfrequenzen. Aufgrund der sinusförmigen Übertragungsfunktion werden niedrige Raumfrequenzkomponenten, die für die Beobachtung von biologischen Proben unerlässlich sind, stark unterdrückt. Eine deutliche Verbesserung der Qualität der Bilder kann durch eine Phasenplatte, die in einem Cs-korrigierten Mikroskop integriert ist, erreicht werden. Die elektronenoptische Phasenplatte ersetzt die Blende in der hinteren Brennebene des Objektivs, und erzeugt eine entsprechende Phasenverschiebung von 90° zwischen den ungestreuten und den von der Probe gestreuten Elektronen. Die Phasenplatte hilft niedrige Frequenzen zu übertragen, während der Cs-Korrektor wesentlich für die Übertragung von höheren Frequenzen ist. So können Bilder nahe dem Fokus aufgenommen werden und die CTF zeigt keine Kontrastumkehr. Derzeit konzentriert sich die Entwicklung auf zwei Arten von Phasenplatten: Zernike- und Boersch-Phasenkontrastsysteme. Die Dünnfilm-Phasenplatte für den Zernike-Phasenkontrast besteht aus einem gleichmäßigen amorphen Kohlenstofffilm mit einem kleinen Loch in der Mitte, durch das die ungestreuten Elektronen ohne zusätzliche Phasenverschiebung propagieren können. Die Phasenverschiebung der gestreuten Elektronen wird durch die Dicke der Kohleschicht bestimmt. Aufgrund verschiedener praktischer Probleme, wie Aufladung, Kontamination und Signalverlust als Folge der inkohärenten Streuung wird sie nicht routinemäßig in der hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskopie eingesetzt. Ein alternativer Ansatz ist die von Boersch im Jahr 1947 vorgeschlagene elektrostatische Phasenplatte. Die ungestreuten Elektronen werden durch das elektrostatische Potential in einer Ringelektrode beeinflusst. Die Elektronen-Materie-Wechselwirkung wird dabei komplett vermieden. Das Hauptproblem der elektrostatischen Phasenplatten ist die Größe der Ringelektrode, die zu einer Abschattung der Elektronen in der Beugungsebene und einem Signalverlust bei niedrigen Raumfrequenzen führt. Das Problem kann durch eine speziell entwickelte elektronenoptische Komponente, die Diffraction Magnification Unit (DMU), überwunden werden, die das Beugungsbild vergrößert. Der Prototyp PACEM (Phase Contrast Aberration Corrected Electron Microscope) wurde von der Carl Zeiss NTS GmbH in Zusammenarbeit mit dem MPI für Biophysik und der CEOS GmbH entwickelt. Die wichtigsten Merkmale sind eine monochromatisierte FEG, ein in-column-Filter, ein Cs-Korrektor und die DMU. Das Objektiv verfügt über einen großen Polschuhspalt entsprechend den Bedürfnissen für Kryo- und Tomographie-Anwendungen. Die DMU ist unterhalb des Cs-Korrektors angeordnet und besteht aus einem Linsendublett. Die erste Linse vergrößert die Beugungsebene in die Hauptebene der zweiten Beugungslinse, wo ein spezieller Phasenplattenhalter und ein Antikontaminator eingesetzt werden können. Diese Anordnung sorgt für eine effektive Brennweite von 15 mm in der zweiten Linse, wo die Phasenplatte angeordnet ist. Die daraus resultierende Vergrößerung der Beugungsebene um den Faktor fünf reduziert Artefakte, die durch die Ringelektrode der Boersch-Phasenplatte verursacht werden und ermöglicht eine kontrastreiche Abbildung schwacher Phasenobjekte über einen großen Bereich von Raumfrequenzen.

Thin biological specimens, consisting of mostly low atomic elements can be described as weak phase objects. In conventional transmission electron microscopy (CTEM), phase contrast is achieved by defocusing the objective lens. This defocus setting leads to strong oscillations of the contrast transfer function (CTF) at high spatial frequencies. Due to the sine-type transfer function low spatial frequency components, which are indispensable for the observation of biological samples, are severely suppressed. Substantial improvement of the quality of the images can be achieved by using a phase plate integrated in a Cs-corrected microscope. The electron-optical phase plate replaces the aperture in the back focal plane of the objective lens, and creates an appropriate phase shift of 90° between unscattered electrons and those scattered by the specimen. The phase plate helps to transfer lower frequencies while the Cs-corrector is essential for the transfer of higher frequencies. Thus, images can be recorded close to focus, and the CTF shows no contrast reversal. Currently, development is focused on two types of phase plates: Zernike and Boersch phase contrast systems. The thin-film phase plate for Zernike-type phase contrast is made of a uniform amorphous carbon film with a small hole in the center where the unscattered electrons propagate without additional phase shift. The phase shift of the scattered electrons is determined by the thickness of the carbon film. Due to various practical problems, such as charging, contamination and signal loss because of incoherent scattering it is not routinely applied in high-resolution transmission electron microscopy. An alternative approach is the electrostatic phase plate proposed by Boersch in 1947. The unscattered electrons are influenced by the electrostatic potential inside a ring electrode. The electron-matter interaction is thereby completely avoided. The main problem of electrostatic phase plates is the size of the ring electrode, which leads to an obstruction of electrons in the diffraction plane and a signal loss at low spatial frequencies. The problem can be overcome by a specially designed electron optical component, the Diffraction Magnification Unit (DMU), which magnifies the diffraction image. The prototype PACEM (Phase Contrast Aberration Corrected Electron Microscope) was developed by Carl Zeiss NTS GmbH, in cooperation with the Max Planck Institute for Biophysics and CEOS GmbH. Its main features include a monochromated FEG, an in-column filter, a Cs-corrector and the DMU. The objective lens has a large pole piece gap according to the needs for cryo- and tomography applications. The DMU is arranged below the Cs-corrector and consists of a lens doublet. The first lens magnifies the diffraction plane into the principal plane of the second diffraction lens where a special phase plate holder and anticontaminator could be employed. This arrangement provides an effective focal length of 15 mm in the second lens, where the phase plate is arranged. The resulting magnification of the diffraction plane by a factor of five significantly reduces artefacts caused by the ring electrode of the Boersch phase plate and allows a high-contrast imaging of weak phase objects over a wide range of spatial frequencies.