Inhaltszusammenfassung:
Neuroprotektion mittels TrĸB-Aptamer an der porcinen Retina
Hintergrund und Zielsetzung
Neurodegenerative Erkrankungen, wie z.B. die altersbedingte Makuladegeneration oder Retinitis pigmentosa, sind relevante Erkrankungen in der Augenheilkunde. Die derzeit verfügbaren Therapien sind noch nicht in der Lage die schleichende Neurodegeneration ausreichend aufzuhalten. Eine wichtige Rolle bezüglich Neuroprotektion im ZNS und auch der Retina spielt der BDNF/Tropomyosin-Rezeptor-Kinase B (TrĸB)-Signalweg. Die Aktivierung des Rezeptors führt zu Zellwachstum und Neuroprotektion. Bisherige Studien zeigen jedoch, dass der natürliche Rezeptorligand BDNF als exogen verabreichtes Therapeutikum, aufgrund der Induktion von Nebenwirkungen, nicht geeignet ist. Daher wurde in dieser Doktorarbeit ein alternativer TrĸB-Ligand, ein TrĸB-Aptamer, untersucht. Das verwendete Aptamer ist ein Agonist mit hoher Affinität zu TrĸB und eignet sich in der Theorie besser als therapeutisches Mittel als BDNF, da es nur ein partieller Agonist von TrĸB ist. In diesem Projekt ging es darum, die geeignete Konzentration des Aptamers zu finden, um TrĸB wirksam zu aktivieren, ohne Nebenwirkungen hervorzurufen. Zudem wurde der zeitliche Verlauf der Rezeptoraktivierung untersucht. Darüber hinaus wurde das primär verwendete RNA-Aptamer mit einem DNA-Aptamer hinsichtlich Wirkung und Verträglichkeit verglichen und die neuroprotektive Wirkung des RNA-Aptamers in einem Blaulicht-Stress-Modell untersucht.
Methoden
Alle Experimente wurden ex vivo an Netzhautexplantaten aus Schweineaugen durchgeführt. Die getesteten Aptamer-Konzentrationen waren 10 nM, 100 nM, 200 nM und 500 nM. Die Expression verschiedener Marker (einschließlich BDNF, p-Akt, TNFα, HSP70) wurde sowohl mittels qRT-PCR als auch mittels Western Blot untersucht. Als Stressmodell zur Induktion von oxidativem Stress und Neurodegeneration in der Netzhaut diente die Blaulichtbestrahlung. Die Auswirkungen dieser Bestrahlung wurden unter anderem mittels Caspase 3/7-Assay und TUNEL-Färbung analysiert.
Ergebnisse
Als wirksamste RNA-TrĸB-Aptamer-Konzentration erwies sich 100 nM bei einer Behandlungsdauer von 24 Stunden. Das RNA-Aptamer war in der Lage, den TrĸB-Rezeptor und seine Signalwege bei einer Konzentration von 100 nM wirksam zu aktivieren. Bei einer längeren Behandlungsdauer von 48 Stunden führte bereits eine Konzentration von 10 nM zu einer wirksamen Rezeptoraktivierung, die mittels Phosphorylierungszustand von p-Akt nachgewiesen wurde. Außerdem führte keine dieser beiden Konzentrationen zu einem Anstieg der Expression von Zellstressmarkern wie TNFα und HSP70, was für eine gute Kompatibilität dieser Aptamerkonzentrationen in der Retina spricht. Erste orientierende, vergleichende Versuche zwischen dem primär verwendeten RNA-Aptamer und einem DNA-Aptamer ergaben eine ähnliche Wirksamkeit und Verträglichkeit in der porcinen Retina. Zur Untersuchung der neuroprotektiven Wirkung der Aptamere wurde die Bestrahlung der Explantate mit Blaulicht eingesetzt. Die Behandlung mit 100 nM Aptameren konnte die durch Blaulicht induzierte Apoptose in gestressten Zellen verhindern und verringerte zudem den induzierten oxidativen Stress signifikant.
Schlussfolgerungen
Das RNA-TrĸB-Aptamer wurde in der Netzhaut in Konzentrationen von 10 nM und 100 nM gut vertragen und aktivierte wirksam TrĸB. Diese Effekte zeigten sich vergleichbar bei der Behandlung mit einem DNA-TrĸB-Aptamer. Neuroprotektive Effekte wurden mit einer Konzentration von 100 nM des RNA-TrĸB-Aptamers induziert, und die Zellen wurden vor der Apoptose in einem Blaulichtstressmodell gerettet.
