Inhaltszusammenfassung:
Die Therapie mit extrakorporalen Membranoxygenatoren (ECMO) während der akuten Phase der kardiogenen Schocks oder im Rahmen einer pulmonalen Insuffizienz, stellt für Patienten oft die letzte Therapieoption dar. Zusätzlich erweitert der Einsatz der HLM während einer Herzoperation die Therapiemöglichkeiten bei Herzerkrankungen. Viele der mit dem Einsatz der ECMO/HLM einhergehenden Komplikationen, sind auf die eingeschränkte Hämokompatibilität solcher Unterstützungssysteme zurückzuführen. Der Kontakt des Patientenblutes mit der Oberfläche der ECMO/HLM und die damit in Verbindung stehenden Komplikationen, stellen daher eine große Hürde im Rahmen der ECMO-Therapie dar.
Eines der zentralen Bauteile einer ECMO ist die Oxygenator-Membran. Sie besteht aus mikroporösen und nicht-mikroporösen Hohlfasermembranen (HFMs), welche aus Polypropylen (PP) oder Polymethylpenten (PMP) bestehen. Durch seine Funktion als Gasaustauschmembran, ist die Oxygenator-Membran die größte mit dem Patientenblut in Kontakt stehende Fläche der ECMO.
Die das humane Gefäßsystem auskleidende Zellschicht besteht aus Endothelzellen. Grundgedanke dieser Arbeit war daher die Entwicklung einer Strategie zur Endothelialisierung der mit dem Patientenblut in Kontakt stehenden Hohlfasermembranen zur Verbesserung der Hämokompatibilität.
Um die Oberfläche der HFMs zu funktionalisieren, wurden die HFMs zunächst mit Sauerstoffplasma behandelt. Durch die Behandlung wurden Hydroxylgruppen (-OH) auf den Oberflächen der HFMs generiert. Um im darauf folgenden Schritt Amino-Gruppen (-NH2) an die Hydroxylgruppen zu binden, silanisierten wir die HFMs mit einer 5% und 8% 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES)-Lösung. Die Bindung der Amino-Gruppen auf der Membran wurden mittels Anfärbung mit Methylorange nachgewiesen. Im nächsten Schritt konjugierten wir zu den auf den Oberflächen der HFMs gebundenen Amino-Gruppen einen N-hydroxysuccinimid-Alkin-Ester (NHS-Alkin Ester) um Alkin-Gruppen an den Oberflächen zu generieren. Nach Konjugation des NHS-Alkins zu den Amino-Gruppen, wurde dieser unter Verwendung der Kupfer(I)-katalysierten Azid/Alkin Cycloaddition (CuAAC) mittels des Fluorophors Cy3-Azid auf den Oberflächen nachgewiesen.
Die CuAAC gehört zu den Reaktionen der sogenannten „Click-Chemie“ und beschreibt die Reaktion eines Azids mit einem Alkin. Nach erfolgreichem Nachweis des NHS-Alkins auf den HFMs wurden im nächsten Schritt VE-Cadherin Antikörper mit einem Azid markiert, um diese in einer weiteren Reaktion mittels CuAAC auf den Oberflächen zu immobilisieren. Die Azid-Gruppe des VE-Cadherin Antikörpers reagierte in diesem Schritt mit dem zur Oberfläche konjugierten NHS-Alkin. Die Immobilisierung des VE-Cadherin Antikörpers auf den HFMs wurde im nächsten Schritt durch Markierung mit einem Sekundärantikörper (Ratte anti-Maus IgG) mit fluoreszierenden Eigenschaften sichtbar gemacht. Nach Biofunktionalisierung der HFMs mit dem VE-Cadherin Antikörper, wurde die Besiedlung der HFMs mit HUVECs (Endothelzellen aus der Nabelschnurvene) analysiert. Die erfolgreiche Bindung der HUVECs an die HFMs, konnte danach durch Anfärbung der Zellen mit Calcein AM nachgewiesen werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Funktionalisierung, sowie eine Biofunktionalisierung der PP- und PMP-HFMs mit den durchgeführten Schritten erfolgreich war. Auch wenn die Menge der auf den Oberflächen der HFMs immobilisierten Zellen gering war und die Zellschicht nicht konfluent war, konnten auf den funktionalisierten HFMs im Vergleich zu nicht biofunktionalisierten HFMs mehr Zellen nachgewiesen werden. Diese etablierte Oberflächenfunktionalisierung kann auch für die Immobilisierung von anderen Azid-markierten Molekülen eingesetzt werden.
