Untersuchung zu dem Einfluss von Onkogenen und proteotoxischem Stress auf das Wachstum von Aml12 Zellen

Abstract

Grundlage dieser Doktorarbeit bilden die in Tabelle 2.1 aufgeführten und von Dr. rer. nat. Mathias Riebold und mir produzierten Zelllinien. Diese Zelllinien bauen auf der nativen Aml12 Zelllinie auf, bei der es sich um modifizierte Mausleberzellen handelt, welche in ihrer Morphologie und ihrem Wachstumsverhalten vergleichbar mit normalen Leberzellen der Maus sind, allerdings in der Zellkultur über 80-mal gesplittet werden können. In diese Zelllinien wurden mit Hilfe der Transduktion Onkogene in die Zellen eingebracht. Bei diesen Onkogenen handelt es sich um die Überexpression des Transkriptionfaktors Myc und die myristoylisierte Form von Akt. Diese Onkogene wurden hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die Aml12 Zellen sowohl solitär als auch zusammen untersucht. Die untersuchten Auswirkungen umfassen das Wachstumsverhalten der Zelllinien in zwei- und dreidimensionalen Medien, die Beeinflussung des Wachstumsverhaltens durch den ER-Stressor Tunicamycin und die Modifizierbarkeit des Wachstumsverhaltens durch den ER-Stress Modifikator Salubrinal. Die Wachstumsgeschwindigkeit unter zweidimensionalen Bedingungen konnte einzig die Zelllinie MycOE-AktMyr in signifikanter Weise gegenüber den nativen Aml12 Zellen steigern. Es bedarf somit der Kombination der Überexpression des Transkriptionsfaktors Myc und der konstitutiv aktiven Form von Akt, um die Wachstumsgeschwindigkeit in einem signifikanten Maße zu steigern. Unter dreidimensionalen Wachstumsbedingungen war lediglich die Zelllinie MycOE in der Lage, makroskopisch sichtbare Kolonien in einer relevanten Menge zu bilden. Der durch die Überexpression von Myc ausgelöste Effekt der Ausbildung großer Kolonien wurde hierbei durch die Kombination mit AktMyr wieder rückgängig gemacht, wodurch die Zelllinie MycOE-AktMyr nicht in der Lage ist, vermehrt große Kolonien zu bilden. Im Falle dieser Kombinationszelllinie könnte die Kombination von AktMyr mit einer Überexpression von Myc in Aml12 Zelllinien zu einer Steigerung der apoptotischen Auswirkung von Myc führen, wodurch das dreidimensionale Wachstum gehemmt wird. Gegenüber des ER-Stressors Tunicamycin zeigten sich bis zu einer Konzentration von ~60µg/l keine relevanten Unterschiede zwischen den Zelllinien. Bei einer Konzentration von 125µg/l und 250µg/l wiesen die Zelllinien MycOE und MycOE-AktMyr eine erhöhte Resistenz gegenüber Tunicamycin auf. In den durchgeführten Western Blots zeigt sich in beiden Zelllinien eine Erhöhung an p-EIF2α unter nicht gestressten Bedingungen. Es ist somit möglich, dass beide Zelllinien durch einen basal erhöhten ER-Stress an diesen angepasst sind und z.B. mit einer Vergrößerung ihres endoplasmatischen Retikulums besser auf eine Erhöhung des ER-Stresses reagieren können. Bei der Behandlung mit dem ER-Stress Modulator Salubrinal zeigt die Zelllinie MycOE die größte Resistenz gegenüber der Behandlung, während die Zelllinie MycOE-AktMyr die höchste Sensitivität gegenüber einer solchen Behandlung aufweist. Es konnte gezeigt werden, dass Salubrinal v.a. das Wachstum von sich schnell teilenden Zellen beeinflusst. Da es sich bei der Zelllinie MycOE-AktMyr um die sich am schnellsten teilende Zelllinie handelt, liefert dies eine Erklärung für die höchste Sensitivität gegenüber Salubrinal.