| dc.description.abstract |
Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (CED) gehen mit Störungen der Darmmikrobiota und fehlgesteuerten Immunreaktionen einher. Flagellin, der natürliche Ligand des Toll-like-Rezeptors 5 (TLR5), gilt als zentraler Vermittler stammspezifischer Wirt-Mikroben-Interaktionen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Hypothese geprüft, ob eine Korrelation zwischen der Gesamtlänge der Flagellin-Sequenz (fliC-Sequenz) und der TLR5-Aktivierung besteht und ob sich daraus protektive Effekte kommensaler E. coli ableiten lassen. Als Vergleichsgröße nutzten wir E.coli Nissle 1917 (EcN), welcher bereits durch viele Studien belegt, protektive Effekte zeigte. Im Rahmen der Untersuchungen wurden E. coli-Isolate aus Stuhlproben gesunder Probanden hinsichtlich ihrer fliC-Länge und ihres Schwärmverhalten charakterisiert und in TLR5-überexprimierenden HEK-Zellen (human/murin) auf ihr TLR5-Aktivierungspotenzial getestet. Als Read-out diente in diesem Kontext die IL-8 Sekretion. Für die nachfolgenden Experimente wurden zwei kontrastierende Isolate ausgewählt: CS238 (lange fliC-Sequenz, hohe TLR5-Aktivierung, ähnlich EcN) und CS222 (kurze fliC-Sequenz, niedrige TLR5-Aktivierung) und mit dem probiotischen Referenzstamm EcN verglichen. Die isolierten kommensalen E. coli-Stämme wiesen eine große Variabilität der fliC-Sequenz-Längen und deutliche Unterschiede im Schwärmverhalten auf. Längere fliC-Sequenzen traten häufiger bei stark schwärmenden Stämmen auf, kürzere eher bei nicht schwärmenden. Die Gesamtlänge allein erwies sich jedoch nicht als verlässlicher Prädiktor für die Motilität, da die funktionelle Bedeutung der einzelnen Flagellin-Domänen maßgeblich ist. Für weiterführende Experimente wurden daher nur schwärmfähige Stämme ausgewählt, um ein funktionsfähiges Flagellum sicherzustellen.
In TLR5-überexprimierenden HEK-Zellen wurde eine ausgeprägte Stamm- und Speziesabhängigkeit der IL-8-Sekretion beobachtet. Mehrere Isolate induzierten in murinen TLR5-Zellen hohe, in humanen TLR5-Zellen jedoch deutlich niedrigere Signale. Diese Unterschiede spiegeln bekannte interspezifische Variationen der TLR5-Sequenz und -Ligandenerkennung wider und unterstreichen, dass Ergebnisse aus Mausmodellen nur eingeschränkt direkt auf den Menschen übertragbar sind. Nach Normierung auf den Stamm EcN ergaben sich Isolate mit hoher (u. a. CS238) und niedriger (u. a. CS222) TLR5-Aktivierung, auf deren Basis die beiden kontrastierenden Stämme, für die in vitro und in vivo -Folgeexperimente ausgewählt wurden. In murinen BMDCs bestätigten die Experimente die zentrale, regulatorische Rolle von TLR5. In TLR5-/--BMDCs kam es im Vergleich zu Wildtyp- und TLR2/4-/--Zellen zu einer verstärkten TNF-α-Produktion, was auf eine Enthemmung anderer TLR-Signalwege hindeutet. Die Analyse der Reifungsmarker (MHC-II, CD80, CD86, CD40) ergab, dass die Maturation primär über TLR2- und TLR4-Signale getrieben wird, während TLR5 eher modulierend wirkt und insbesondere die Ausprägung kostimulatorischer Moleküle begrenzt. Flagellin allein induzierte nur eine schwache BMDC-Maturation, was die Rolle von TLR5 als feinregulierenden, nicht primär treibenden Faktor der DC-Aktivierung unterstützt.
Im DSS-Kolitis-Mausmodell konnte zunächst gezeigt werden, dass eine Kolonisation mit EcN sowie den transformierten und somit Chloramphenicol-resistenten Isolaten CS222 pHP45Ω catR und CS238 pHP45Ω catR über das Trinkwasser zuverlässig zu erreichen ist. Auf klinischer Ebene (Körpergewicht) unterschieden sich die Gruppen zwar nicht signifikant, jedoch ergab die histologische Analyse eine deutliche Reduktion des Schädigungsscores (HCS) in allen kolonisierten Gruppen im Vergleich zur DSS-behandelten, nicht mit E.coli-kolonisierten Kontrollgruppe (DSS-Only), mit dem stärksten protektiven Effekt bei EcN. Die kommensalen Stämme CS222 pHP45Ω catR und CS238 pHP45Ω catR führten ebenfalls zu einer signifikanten Verminderung der histologischen Schädigung, wenn auch weniger ausgeprägt als EcN.
Der Disease-Activity-Index zeigte eine klarere Differenzierung: Tiere, die mit EcN oder CS238 kolonisiert waren, wiesen signifikant niedrigere DAI-Werte auf als die DSS-Only-Gruppe und die CS222-Gruppe. Damit bestätigte sich die Hypothese, dass ein Stamm mit langer fliC-Sequenz und hoher TLR5-Aktivierung (CS238) protektive Effekte ähnlich EcN entfalten kann, während ein Stamm mit verkürzter fliC-Sequenz und niedriger TLR5-Aktivierung (CS222) keinen oder sogar einen ungünstigen Einfluss auf den Krankheitsverlauf hat.
Die Kolonlängenmessungen zeigten zwar die typische Verkürzung im Rahmen der DSS-Kolitis, verursachten aber keine signifikanten Gruppenunterschiede und erwiesen sich damit eher als ergänzender, weniger sensitiv differenzierender Parameter.
Die immunologischen Analysen bestätigten die stammspezifischen Unterschiede. In den Gruppen EcN und CS238 pHP45Ω catR fand sich eine erhöhte Zahl neutrophiler Granulozyten im Kolon bei gleichzeitig milderer Kolitis und tendenziell niedrigerer TNF-α-Sekretion, ein Befund, der als Ausdruck einer effektiven, aber kontrollierten Immunantwort interpretiert wurde. Demgegenüber waren DSS-Only und CS222 mit tendenziell höheren TNF-α-Werten, dysregulierter Neutrophilenrekrutierung und erhöhter Th17-Frequenz assoziiert, passend zu einem schwereren, proinflammatorisch geprägten Verlauf.
Zusammenfassend zeigt die Arbeit, dass Stämme mit längerer fliC-Sequenz und hoher TLR5-Aktivierung (EcN, CS238) im DSS-Kolitis-Modell eine abgeschwächte Entzündungsreaktion bei erhaltener Immunfunktion zu fördern scheinen, während ein Stamm mit verkürzter fliC-Sequenz und niedriger TLR5-Aktivierung (CS222 pHP45Ω catR) keine protektiven Effekte zeigt. Trotz methodischer Limitationen (siehe 5. Limitationen) liefert die Arbeit wichtige Hinweise darauf, dass nicht die Artzugehörigkeit zu E. coli, sondern Stamm-spezifische, insbesondere Flagellin- und TLR5-vermittelte Eigenschaften über protektive oder pathogene Wirkungen entscheiden. Dies bildet eine Grundlage für die gezielte Entwicklung Stamm-spezifischer probiotischer und mikrobiomgestützter Therapiestrategien bei entzündlichen Darmerkrankungen. |
de_DE |
