Therapieansatz mit Antisense-Oligonukleotiden in einem Mausmodell der Spinocerebellären Ataxie Typ 3

Abstract

Die Spinocerebelläre Ataxie Typ 3 (SCA3) ist eine neurodegenerative, genetisch bedingte Erkrankung aus dem Formenkreis der Polyglutamin-Erkrankungen. Die zugrunde liegende Mutation ist eine Expansion der CAG-Sequenz im zugehörigen Ataxin-3 Gen, durch welche im entsprechenden Protein eine Polyglutamin-Kette entsteht. Diese beeinflusst die Proteinfaltung so, dass es zu Proteinaggregaten in verschiedenen motorischen Zentren des Gehirns wie dem Cerebellum, dem Hirnstamm und den Basalganglien kommt. Diese Aggregate scheinen zur Neurodegeneration beizutragen, welche im Verlauf auftritt. Dies bewirkt einen Koordinationsverlust, der innerhalb von 10-15 Jahren zur Immobilität führt. Die PatientInnen versterben vor allem an Aspirationspneumonien und Infektionen. Aktuell stehen nur symptomatische Therapien zur Verfügung, wie intensive Physiotherapie oder Medikamente aus dem Bereich der Parkinsonbehandlung. Zur kausalen Behandlung werden daher Gentherapien immer attraktiver. In dieser Promotion wurden zwei Ansätze mit Antisense-Oligonukleotiden (ASOs) getestet, die die mRNA des Ataxin-3 binden und mittels Rekrutierung der RNAseH1 abbauen sollten, sodass konsekutiv auch das Protein Ataxin-3 herunterreguliert werden sollte. Dafür wurde das SCA3 WT/YAC84Q-Mausmodell verwendet, da dieses den humanen Genlocus des Ataxin-3 mit allen regulatorischen Elementen exprimiert. Der erste Ansatz wurde allel-unspezifisch entwickelt, sodass die ASOs sowohl das mutante als auch das wildtypische ATXN3 regulieren sollten. Dies ist vertretbar, da sich in Tiermodellen gezeigt hat, dass ATXN3 für eine normale Zellfunktion nicht obligat zu sein scheint. In einem zweiten Ansatz wurden allel-spezifische ASOs getestet, die den Polymorphismus c.987G>C binden. Dieser ist mit der CAG-Sequenz assoziiert und liegt bei 70% der PatientInnen weltweit vor. Der SNP wird auch in der WT/YAC84Q-Maus abgebildet. Durch die sogenannte mutASO sollte nur das mutante ATXN3 reguliert werden, nicht jedoch das wildtypische. Die ASOs wurden im Alter von 7-10 bzw. 10-12 Wochen jeweils mittels intracerebroventrikulärer Injektion in die Gehirne der Versuchstiere eingebracht, um durch die Liquorzirkulation im ZNS verteilt zu werden. Nach 7 bzw. 4 Wochen wurden die Gehirne präpariert. Im Falle der allel-unspezifischen ASOs wurden die Expressionslevel der RNA des mutanten ATXN3 mittels qRT-PCR bestimmt. In der Studie der allel-spezifischen ASOs wurden die Expressionslevel des humanen ATXN3 mittels Western Blot analysiert. Außer für die allel-unspezifische ASO 3 im Frontalen Cortex konnte keine signifikante Regulation beobachtet werden. Als mögliche Erklärungen ist besonders auf die genaue Injektionsstelle, die chemischen Modifikationen, die Generation und die Dosis der ASOs sowie die Zeit zwischen Injektion und Präparation einzugehen. Die allel-unspezifischen ASOs wurden gut vertragen. Die meisten beobachteten Auffälligkeiten zum Gewicht sowie dem Phänotyp konnten ebenso in der Kontrollgruppe festgestellt werden und schienen daher im Zusammenhang mit dem OP-Verfahren zu stehen. Im Falle der mutASO dagegen wurde eine starke konzentrationsabhängige (Neuro-)Toxizität festgestellt. Diese zeigte sich vor allem im Phänotyp durch Tremor und reduzierte koordinatorische Fähigkeiten, welche im Wirehang-Test auffielen. Als mögliche Ursache ist auch hier die Injektionstechnik zu diskutieren. Die direkte Applikation ins Gehirn ist mit einem hohen OP-Risiko und der Gefahr einer Immunreaktion verbunden. Weiterhin ist ein Zusammenhang zwischen der chemischen Struktur der ASOs und erhöhter Toxizität beschrieben. Es ist bekannt, dass eine erhöhte Guanin-Anzahl in der Sequenz der ASO zu einer starken akuten Neurotoxizität führen kann. Die Toxizität der mutASO entwickelte sich jedoch nicht nur akut, sondern auch über einige Tage hinweg. Als Erklärung könnte eine systemische Reaktion in Betracht gezogen werden. Es ist zu diskutieren, ob es zusätzlich zur akuten auch eine langfristige Neurotoxizität gibt, die so bisher noch nicht beschrieben wurde. Außerdem sind das Alter und Gewicht sowie die transgene Mauslinie als weitere Faktoren der Toxizität zu beleuchten. Aktuell werden dazu erste systematische Toxizitätsstudien in Mausmodellen neurodegenerativer Erkrankungen veröffentlich. Jedoch ist das Wissen über die Unverträglichkeitsreaktion beim Menschen noch sehr begrenzt. Zusammenfassend liefern die hier dargestellten Studien potenzielle Hypothesen zur Klärung der Frage, wieso in vitro vielversprechende Therapieansätze in vivo nicht wirksam sind. Weiterhin wird die Frage aufgeworfen, wodurch die Toxizität der allel- spezifischen ASOs genau verursacht wird und besonders wodurch die langfristige Komponente der (Neuro-)Toxizität bedingt ist. Um diese Fragen abschließend zu klären, wären weitere systematische Untersuchungen notwendig.