Analyse der in vivo-Funktion des Transkriptionsfaktors SRF in adulten Glattmuskelzellen der Maus

Abstract

Um die Funktion von SRF in adulten Glattmuskelzellen in vivo zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Strategie einer zeitlich-steuerbaren, konditionalen Deletion im genomischen Srf-Lokus in Glattmuskelzellen adulter Mäuse entwickelt. Durch die Kreuzung der Srf flex1-Mauslinie, in deren Genom das Exon1 des Srf-Gens von zwei Cre-Erkennungssequenzen (lox-P sites) flankiert ist und somit durch Cre-vermittelte Exzision entfernt werden kann (Wiebel et al. 2002), mit einer Cre-Mauslinie, welche eine Tamoxifen-induzierbare Cre-Rekombinase unter dem Glattmuskel-spezifischen SM22α-Promotor exprimiert (Kuhbandner et al. 2000), wurden zeitlich-induzierbare, Glattmuskel-spezifische, SRF-defiziente Mäuse generiert, welche eine Analyse der Auswirkungen der SRF-Defizienz in adulten Glattmuskelzellen erlaubt. Durch die Applikation von Tamoxifen an fünf aufeinanderfolgenden Tagen konnte eine effiziente Rekombination des Srf flex1-Lokus in vaskulären und viszeralen Glatt-muskelzellen in vivo und damit eine signifikante Reduktion der SRF-Proteinmengen in ausschließlich glattmuskulären Organen erzielt werden. Innerhalb von 16 Tagen nach der ersten Applikation von Tamoxifen war eine 100%ige Letalität der Glattmuskel-spezifischen Srf-knockout-Tiere nachzuweisen. Ex vivo isometrische Kraftmessungen an intakten Intestinalgewebe zeigten eine drastisch reduzierte Kontraktionsfähigkeit der intestinalen Glattmuskulatur, was schwerwiegende Defekte in der Nahrungspropulsion und folglich einen letalen “Ileus paralyticus” verursachte. Anhand zell- und molekularbiologischer Untersuchungen von isolierten, adulten, SRF-defizienten Glattmuskelzellen aus dem Darm wurde gezeigt, dass die Depletion von SRF drastische Veränderungen der Glattmuskelzellen verursachte. Die stark ver-änderte Morphologie der Glattmuskelzellen, einhergehend mit einem gestörten Expressionsprogramm Glattmuskel-spezifischer Markergene, bestätigte die essentielle Funktion von SRF bei der Aufrechterhaltung des Glattmuskel-Phänotyps. Zusätzlich implizierte die erhöhte Seneszenzrate innerhalb SRF-defizienter Glattmuskelzell-populationen eine bedeutende Rolle von SRF bei der Inhibierung zellulärer Seneszenz. Gleichzeitig zeigten SRF-depletierte Glattmuskelzellen ein massiv degeneriertes Aktin-Zytoskelett, was erneut die essentielle Funktion von SRF bei der Aufrechterhaltung intakter Aktin-zytoskelettaler Strukturen bestätigte. Die genaue Ursache der verminderten Kontraktionsfähigkeit der SRF-defizienten Glattmuskulatur des Intestinaltraktes konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht vollständig geklärt werden. Jedoch schienen die durch SRF-Depletion hervorgerufenen zellulären Defekte der Glattmuskelzellen, charakterisiert durch einen Verlust Glattmuskel-spezifischer Eigenschaften und schwere Defekte des Aktin-Zytoskeletts, für die letalen Störungen der intestinalen Motilität verantwortlich zu sein. Mutationen im Srf-Gen oder Veränderungen in der SRF-Expression könnten somit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Erkrankungen des Glattmuskelgewebes, wie z. B. bei der CIPO, spielen. Die vorliegende Arbeit vervollständigt somit vorausgegangene Studien zur Analyse der Funktion von SRF in Muskelzellen, sowohl während der Entwicklung (Miano et al. 2004; Parlakian et al. 2004; Li et al. 2005), als auch im adulten Muskelgewebe (Parlakian et al. 2005; Charvet et al. 2006). Durch die gewonnenen Ergebnisse kann dem Transkriptionsfaktor SRF eine essentielle Rolle zur Aufrechterhaltung Glattmuskel-spezifischer Eigenschaften und zur Gewährleistung der kontraktilen Funktionalität adulter Glattmuskelzellen zugeschrieben werden.

To determine the function of SRF in adult smooth muscle cells (SMCs) in vivo, we conditionally mutated the Srf gene in SMCs by crossing mice carrying a floxed Srf allele (Srf flex1), in which the exon1 is flanked by recognitions sites (loxP sites) for the cre recombinase allowing cre mediated excision (Wiebel et al. 2002), with SM-CreERT2(ki) transgenic mice, which express a tamoxifen-inducible Cre recombinase under the control of the SM-specific SM22_ promoter (Kuhbandner et al. 2000). Induction of recombination initiates the desired Srf mutation in a cell type-specific fashion at any experimentally chosen time allowing to analyse the effects of SRF deficiency in adult SMCs. Application of tamoxifen on five consecutive days resulted in efficient recombination of the Srf flex1 locus in vascular and visceral SMCs in vivo, and therfore in significant reduction of SRF protein levels exclusively in SM-organs. Within 16 days after the first tamoxifen injection there was 100% lethality of the SM-specific Srf-knockout mice. Ex-vivo tension recordings with intestinal SM-tissues showed a drastic reduced contractile activity of the intestinal SM-layer leading to severe defects in food propulsion and finally to a lethal “Ileus paralyticus”. Cellular and molecular analyses of isolated adult, SRF-deficient SMCs of the colon showed that SRF-depletion led to drastic alterations of the SMCs. Obvious morphological changes, accompanied by an altered expression profile of SM-specific marker genes, confirmed essential functions of SRF to maintain the SM-phenotype. Additionally, elevated senescence within the SRF-deficient SMC populations implicated a significant role of SRF in the process of inhibiting cellular senescence. Concomitant, SRF-depleted SMCs showed a clearly degenerated actin stress fiber network, again underlining the importance of SRF to ensure actin cytoskeletal network structures. In the course of this work, the definite cause of the defects in the contractile activity of the SRF-depleted intestinal smooth muscle layers could not be fully clarified. However, the severe cellular defects, characterized by the loss of SM-specific features and severe defects in the actin cytoskeletal network, caused by SRF deficiency, could be responsible for the lethal intestinal dysfunction. Mutations of the Srf gene or alterations of the SRF expression may therefore play an important role in the development of diseases of the smooth muscle tissue, e.g. CIPO. In conclusion, the presented work extends previous analyses addressing SRF function in developing (Miano et al. 2004; Parlakian et al. 2004; Li et al. 2005) and adult (Parlakian et al. 2005; Charvet et al. 2006) muscle cells. These results demonstrate that the transcription factor SRF fulfils vital functions in adult SMCs to maintain fundamental SM-specific properties and to ensure contractile functions.