Development and application of new tools for studying Cathepsin E and D in MHC II pathway

Abstract

The present work aims to contribute to the understanding of differences in biochemical characteristics of cathepsin E and D and their possible functional role in MHC II pathway. More specifically, the project intended to develop and characterize new tools for studying these proteases that are very similar in their enzymatic characteristics. For specific determination of cathepsin E and D activity an assay combining a new monospecific CatE antibody and substrate Mca-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2 [where Mca is (7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl and Dnp is dinitrophenyl] is developed. This substrate is digested by both proteinases and therefore can be used to detect the total aspartic proteinase activity (TAPA) in biological samples. After depletion of CatE by immunoprecipitation, the remaining activity is due to CatD, and the decrease of activity can be assigned to CatE. This assay distinguishes between the activities of enzymatically similar proteinases CatE and CatD and therefore can be used in studies aimed at understanding the involvement of these enzymes in antigen processing and presentation. Moreover, a detailed substrate profiling of cathepsin E and D was performed. It was found that presence of basic residues i.e. R, K and H especially at position P3 is preferred by cathepsin E. Unfortunately we were unable to identify exclusive substrate for CatE or D. However, the detailed specificity profiling of cathepsin E and D led to the identification of preferable residues at different positions that can help in designing of specific substrates or selective inhibitors for cathepsin E or D. Additionally, new cell permeable aspartic protease inhibitors were synthesized by conjugating pepstatin A with well-known cell-penetrating peptides (CPPs). To achieve this, the most frequently used CPPs, namely pAntp(43-58) (penetratin), Tat(49-60), and 9-mer of L-arginine (R9) were synthesized followed by coupling pepstatin A to the peptides. The enzyme inhibition properties of these bioconjugates and their cellular uptake into MCF7 (human breast cancer cell line), Boleths (EBV-transformed B cell line) and dendritic cells (DC) was studied. It was found that the bioconjugate PepA-penetratin (PepA-P) was the most efficient cell-permeable aspartic protease inhibitor in comparison to PepA. Additionally, we found that PepA-P efficiently inhibited the tetanus toxoid C-fragment processing in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), primary DC and in primary B cells. This inhibition of tetanus toxoid C-fragment processing by PepA-P clearly implicates the role of aspartic proteinases in antigen processing.

Mit der vorliegenden Arbeit soll ein Beitrag zum besseren Verständnis der Unterschiede von Cathepsin E und D in ihren biochemischen Charakteristika sowie ihrer möglichen Rolle im MHC-II-Stoffwechsel geleistet werden. Hierfür wurden neue Verfahren zur Untersuchung dieser in ihren enzymatischen Eigenschaften sehr ähnlichen Proteasen entwickelt und charakterisiert. Zur spezifischen Bestimmung der Aktivität von Cathepsin E und D wurde ein neuer Test entwickelt, der auf neuen monospezifischen CatE-Antikörpern und dem Substrat Mca-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2 (Mca: (7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl; Dnp: Dinitrophenyl) basiert. Das Substrat wird von beiden Proteinasen gespalten und kann deshalb zur Messung der Gesamtaktivität der Aspartatproteasen (TAPA) in biologischen Proben benutzt werden. Nach Abtrennung von CatE durch Immunpräzipitation ist CatD für die Restaktivität verantwortlich, während die Aktivitätsabnahme CatE zugeschrieben werden kann. Dieser Test unterscheidet zwischen den Enzymaktivitäten der enzymatisch ähnlichen Proteinasen CatE und CatD und kann deshalb zur Untersuchung der Beteiligung dieser Enzyme an der Antigenprozessierung und –präsentation benutzt werden. Weiterhin wurde ein detailliertes Substratprofil von Cathepsin E und D erstellt. Dabei zeigte sich, dass Substrate mit basischen Resten wie R, K und H, vor allem an Position P3, von Cathepsin E besser gespalten werden als von Cathepsin D. Leider gelang es nicht, ein ausschließlich von CatE oder CatD spaltbares Substrat zu finden. Durch die detaillierte Untersuchung der Spezifitäten der Cathepsine E und D konnten jedoch an verschiedenen Positionen Aminosäurereste identifiziert werden, die jeweils bevorzugt von einem der beiden Enzyme gespalten werden und somit helfen könnten, spezifische Substrate oder selektive Inhibitoren für Cathepsin E und D zu entwickeln. Zusätzlich wurden durch Kombination von Pepstatin A mit bekannten zellpenetrierenden Peptiden (CPPs) neue zellpermeable Aspartatproteaseinhibitoren synthetisiert. Hierfür wurden die meistbenutzten CPPs pAntp(43-58) (Penetratin), Tat(49-60) und ein Nonamer von L-Arginin (R9) synthetisiert und Pepstatin A daran gekoppelt. Bei der Untersuchung der Inhibitionseigenschaften dieser Biokonjugate sowie ihrer Aufnahme in MCF7 (humane Brustkrebs-Zelllinie), Boleth (EBV-transformierte B-Zelllinie) und Dendritische Zellen (DC) erwies sich das Biokonjugat Pepstatin-A-Penetratin (PepA-P) als der im Vergleich zu Pepstatin A effizienteste zellpermeable Aspartatproteaseinhibitor. Außerdem konnten wir zeigen, dass PepA-P die Prozessierung des Tetanustoxin-C-Fragments in Mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMC), primären Dendritischen Zellen und primären B-Zellen effizient inhibiert. Diese Hemmung der C Fragment-Prozessierung durch PepA-P impliziert deutlich eine Rolle der Aspartatproteasen bei der Antigenprozessierung.