Charakterisierung des Bindungsverhaltens verschiedener Modulatoren der ATP-abhängigen K+-Kanäle (KATP) an den nativen vaskulären KATP-Kanal und seine rekombinant exprimierte Untereinheit SUR2B

Abstract

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das Bindungsverhalten der Radioliganden 3H-P1075 (Kaliumkanalöffner) und 3H-Glibenclamid (3H-GBC, Kanalschliesser) an Membranen von A10- Zellen (glatte Muskelzellen aus der embryonalen Rattenaorta) als Modell des vaskulären ATP- abhängigen K+-Kanals (KATP) untersucht und mit früheren Studien an intakten Zellen verglichen. Dabei konnte die dort gefundene eine Öffnerbindungsstelle für P1075 an A10-Zellmembranen auf dem Sulfonylharnstoffrezeptor SUR2B, der ß-Untereinheit des vaskulären KATP-Kanals, bestätigt werden. Die mittels 3H-P1075 und 3H-GBC untersuchte GBC-Bindung verlief jeweils zweistufig: Die erste, hochaffine (KD = 36 nM) Bindungsstelle (20 der spezifischen GBC-Bindung) liegt am SUR und ist mit der Öffnerbindungsstelle negativ allosterisch gekoppelt. Die Stöchiometrie der ersten GBC-Bindungsstelle und der P1075-Bindungsstelle beträgt 1:1. Die zweite, niederaffine (µM Bereich) Bindungsstelle liegt an einem unbekannten, vermutlich endogenen Protein. Im Gegensatz zur Öffnerbindung ist die GBC-Bindung von der Intaktheit des Zytoskeletts abhängig. Im zweiten Teil wurde an mit SUR2B transfizierten HEK293-Zellmembranen (human embryonal kidney cells) erstmalig das Bindungsverhalten von P2- (Purin- bzw. Pyrimidin-) Rezeptor-Modulatoren untersucht. Ziel war die Auffindung neuartiger KATP-Kanal-Blocker, die über eine Senkung der Reninfreisetzung aus den juxtaglomerulären Zellen der Niere zur Bekämpfung des renalen Hochdrucks beitragen könnten. Phloxin B, Suramin, Evans Blue bzw. DIDS (4-4'- Diisothiocyanostilben-2,2'-disulfonsäure) verdrängten 3H-P1075 vom SUR ein- bzw. zweistufig. Die Verdrängung verlief nicht-kompetitiv mit 3H-P1075, die Bindungsstelle(n) der Testsubstanzen ist (sind) negativ mit der 3H-P1075-Bindungsstelle gekoppelt. Eine Interaktion mit den Nukleotidbindungsstellen konnte nicht ausgeschlossen werden. Die genaue Lokalisation der Bindungsstelle ist noch nicht bekannt.

The first part of this thesis investigates the binding of the radioligands 3H-P1075 (potassium channel opener) and 3H-Glibenclamid (3H-GBC, potassium channel blocker) to A10 cell membranes (smooth muscle cells of the embryonal rat aorta) as a model of the vascular ATP sensitive potassium channel (KATP) and compares it to earlier results of binding experiments on whole cells. As found in those earlier investigations there was only one binding site for P1075 to A10 cell membranes. This site is located at the sulfonylurea receptor (SUR) which is the ß-subunit of the vascular KATP. The potassium channel blocker GBC showed a two-phase binding using 3H-P1075 and 3H-GBC. The first binding site (20 of the specific binding of GBC) with high affinity (KD = 36 nM) is located at SUR and is coupled in a negative allosteric manner to the opener binding site. The stoichiometry of the first GBC binding site and the binding site for P1075 is 1:1. The second binding site of GBC was of low affinity (µM range) and is located at an unidentified, probably endogenous protein. In contrast to the opener binding the binding of GBC depends on the integrity of the cytoskeleton. The second part investigates the binding of P2- (purine-/pyrimidine-) receptor modulators to SUR2B expressed in membranes of HEK293 cells (human embryonal kidney cells) in order to find new blockers of the KATP, which might reduce the secretion of renin from the juxtaglomerular cells of the kidney and thus help to fight against renal hypertension. Phloxin B, Suramin, Evans Blue and DIDS (4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonate) inhibited 3H-P1075 binding to SUR showing a one- respectively two-phase binding. The inhibition was non-competitive with 3H-P1075 and the binding site(s) of the test compounds were coupled in a negative allosteric manner to the binding site of 3H-P1075. The exact localization of the binding site is not yet identified.