Quantitative Analyse der Interleukin 16-Transkription in aktivierten Fibroblasten

Abstract

Das Hauptinteresse der vorliegenden Doktorarbeit galt der pharmakologischen Beeinflußbarkeit sowie der quantitativen Analyse der IL-16-Transkription in aktivierten Fibroblasten. Dieses Zytokin scheint in der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis (RA) eine wichtige, vermutlich proinflammatorische Rolle zu spielen. Darüberhinaus wurde an einigen Fibroblastenkulturen die Transkriptions-Regulation von IL-18 untersucht, ein weiteres Zytokin, das in erhöhter Konzentration im Synovium von RA-Patienten nachweisbar ist. Für die Experimente wurden dermale und synoviale Fibroblasten von 6 Osteoarthrose (OA)- bzw. Traumapatienten sowie Hautfibroblasten einer neonatalen und adulten Zellinie gesunder Spender herangezogen. Zum Zeitpunkt der Versuche stand leider kein Gewebe von RA-Patienten zur Verfügung. Es kann aber davon ausgegangen werden, daß die Regulation der Zytokin-Transkription in humanen Fibroblasten von RA- und OA- bzw. Traumapatienten im Prinzip den gleichen Mechanismen unterliegt. In einem ersten Versuchsansatz wurden die Fibroblasten (meist in der 3. Subkultur) über 24 h parallel mit jeweils einem von 9 verschiedenen Pharmaka, die in unterschiedliche Signaltransduktionswege eingreifen, inkubiert. Anschließend erfolgte die exakte Quantifizierung der IL-16- bzw. IL-18-mRNA-Menge mittels quantitativer RT-PCR im LightCycler. Für jede Substanz wurde nun die pharmakologisch beeinflußte Transkriptmenge verglichen mit derjenigen einer unbehandelten Kontrolle. Durch die Inkubation mit Forskolin, einem Aktivator der Adenylatzyklase sowie durch den Proteinkinase C (PKC)-Inhibitor Staurosporin zeigte sich eine Zunahme des IL-16-Signals. Für Staurosporin konnte in weiteren Experimenten darüberhinaus eine dosisabhängige Induktion der IL-16-Expression sowie eine Zunahme der Induktion mit steigender Inkubationsdauer (von 6 h bis max. 48 h) festgestellt werden. Auf die Transkription von IL-18 hatten diese beiden Substanzen die entgegengesetzte Wirkung. Es zeigte sich sowohl durch Forskolin als auch durch Staurosporin eine merkliche Signalreduktion. Die Behandlung der Fibroblasten mit H7 (Breitspektrum-PK-Inhibitor) und Ocadaic Acid (Proteinphosphatase (PP)-Hemmung) führte bei den Hautfibroblasten zu einer signifikanten Reduktion der IL-16- und zu einer recht deutlichen Verringerung der IL-18-Transkription. Für die übrigen eingesetzten Pharmaka ergab sich keine wesentliche Veränderung des Transkriptionsmusters beider Zytokine. Bei der Inkubation der synovialen Fibroblasten mit den gleichen Chemikalien zeigten sich im großen Ganzen ähnliche Auswirkungen auf die Transkription von IL-16 und IL-18 wie bei den dermalen Fibroblasten. Die Experimente deuten somit auf eine Beteiligung eines cAMP- bzw. kinase-/ phosphatase-abhängigen Signaltransduktionsweges an der Steuerung dieser beiden Zytokine hin. Für einen eventuellen therapeutischen Einsatz bei der RA, der eine Manipulation des IL-16- (oder IL-18-) Spiegels zum Ziel hat, kämen demnach die genannten Substanzklassen in Frage.

The main interest of this thesis was the quantitative analysis of the IL-16-transcription in activated fibroblasts and means of pharmacological influence thereof. IL-16 seemingly plays an important, presumably pro-inflammatory role in the pathogenesis of Rheumatoid Arthritis (RA). Additionally in some fibroblast cultures we investigated the regulation of IL-18-transcription, another cytokine found in increased concentrations in synovial tissue in RA patients. For the experiments we used dermal and synovial fibroblasts of 6 osteoarthrosis (OA) or trauma patients as well as normal dermal fibroblasts of a neonatal and an adult cell line derived from healthy donors. Unfortunately, there was no tissue of RA patients available at the time of the experiments. Yet it can be assumed that principally the regulation of cytokine transcription in human fibroblasts of RA and OA/trauma patients underlies the same mechanisms. In a first row of experiments we expanded the fibroblasts (dermal and synovial) to less than 4 passages and incubated them over 24 hours with 9 different agents triggering key signals of cell activation. Afterwards we determined steady state transcript amounts encoding IL-16 or IL-18 by real time quantitative RT/PCR (LightCycler) and analysed the differences in comparison to mock controls (untreated cells). Incubation with forskolin (adenylate cyclase activator) and with staurosporine, a protein kinase C inhibitor showed enhanced IL-16 steady state mRNA levels in dermal fibroblasts. In further experiments we found that staurosporine leads to a dose- and time-dependent induction of IL-16-expression, longer incubation periods leading to higher IL-16 RT/PCR-signals. Both substances showed opposite effects on the IL-18-transcription. Incubation with both staurosporine and forskolin resulted in a noticeable reduction of the IL-16-signal. Treatment of dermal fibroblasts with H7 (broad protein kinase inhibitor) and ocadaic acid (protein phosphatase inhibitor) led to a significant reduction of IL-16- and to a clear decrease of IL-18-transcription. For all the other agents no considerable changes in transcript amounts of both IL-16 and IL-18 could be found. Incubation of synovial fibroblasts with these 9 substances showed by and large similar effects on transcription rates. Altogether, the experiments indicate that cAMP- or kinase-/phosphatase-dependent signal transduction pathways are involved in the regulation of both cytokines. Therefore the above-mentioned substances ought to be considered useful for a possible treatment of RA aiming to influence IL-16 (or IL-18) levels.