Identifikation der Zielstruktur eines mit murinen Megakaryozyten kreuzreagierenden anti-humanen Citrullin Antikörpers

Abstract

Bisher galten CD41 und CD61 (Alpha II- bzw. Beta III-Integrin) als klassische Marker thrombozytopoetischer Zellen. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass auch der Rabbit Anti-Citrulline Antikörper (in dieser Arbeit: „RAC“) der Firma Upstate (Cat.: #24232) murine Megakaryozyten linien- und speziesspezifisch erkennt.

Zum Nachweis dieser Tatsache wurden aus Black 6 Wildtypmäusen Knochmarkzellen gewonnen und mittels Lineage Cell Depletion die Megakaryozyten sowie deren Vorläuferzellen isoliert. Diese wurden mit X-Vivo 20 In Kultur genommen und mit Zytokinen (SCF und TPO) stimuliert, woraufhin es zu einer starken Proliferation und megakaryozytentypischen Endomitose der Zellen kam. Die Reinheit der gewonnenen Zellkulturen konnte zudem durchflusszytometrisch bestätigt werden. In diversen immunhistochemischen und Immunfloureszenz-Färbungen zeigte sich, dass der RAC-Antikörper an dieselben Zellstrukturen bindet wie die klassischen Marker CD41 und CD61. Die Expression in megakaryozytären Vorläuferzellen beginnt ungefähr zeitgleich mit dem Erscheinen von CD61 auf der Zelloberfläche. Der RAC-Antikörper wurde durch Immunisierung von Kaninchen mit citrullinierten Peptiden gewonnen. Da beim RAC-Antikörper eigentlich eine Speziesspezifität für Mensch angenommen werden sollte, wurden zunächst menschliche Zellen bzw. Gewebe auf Reaktivität getestet. Hier zeigte sich allerdings keine Bindung, so dass postuliert wurde, dass die Reaktion mit murinen Megakaryozyten eher eine zufällige Kreuzreaktion als eine spezifische Bindung an ein citrulliniertes Zielantigen mit Sequenzhomologie zur Vakzine widerspiegelt.

Weitergehende Untersuchungen zielten dementsprechend auf die Isolation der unbekannten Zielstruktur in murinen Megakaryozyten ab. Hierzu kamen Western Blot sowie Immunpräzipitation zum Einsatz. Die hier gewonnenen neuen Banden wurden nachfolgend massenspektrometrisch analysiert. Beim Abgleich der Ergebnisse mit Proteom-Datenbanken zeigte sich die höchste Übereinstimmung mit Cullin5 und Ptpn13. Beide Proteine sind bisher nicht in Megakaryozyten beschrieben. Aufgrund ihrer regulativen Funktionen im Zusammenhang mit Zellproliferation und –differenzierung ist es prinzipiell denkbar, dass sie die Endomitose regulieren und deshalb in Megakaryozyten spezifisch exprimiert gefunden werden. Beide Proteine konnten in immunhistochemischen Färbungen in Megakaryozyten nachgewiesen werden, die endgültige Unterscheidung gelang im Rahmen dieser Arbeit nicht.

Zusammenfassend kreuzreagiert der untersuchte Rabbit anti-Human Citrullin Antikörper mit einer spezifisch in murinen Megakaryozyten exprimierten Zielstruktur. Es handelt sich entweder um Ptpn13 oder Cullin5.

Until now CD41 and CD61 were known as the classical markers of thombopoietic cells. But in this paper we could show that as well the rabbit anti-citrulline antibody (in the following "RAC") of the company Upstate (Cat.: #24232) identifies murine megakaryocytes specifically. The specifity of the interaction between antibody an the target structure was characterized as specific in cell lineage as well as in it species. The time of expression of the target structure while megakaryopoiesis was determined and finally the target structure itself could be isolated and identified as either ptpn13 or cullin5.