The effects of a single intravitreal injection of the VEGF-A-inhibitors aflibercept and ranibizumab on glomeruli of monkeys

Abstract

Fenestrated capillaries are found in tissues where filtration through a selective barrier is needed. This is for example the case in the eye where avascular tissues have to be nourished. Fenestrated capillaries of the choriocapillaries of the retina represent the blood-retina barrier and in the ciliary body aqueous humor has to be separated from the blood. In the kidney, the glomerular capillary wall realizes filtration through the blood-urinary barrier. This is realized by specialized fenestrated endothelium and this phenotype is strongly dependent on VEGF (vascular endothelial growth factor). One of the main functions of the VEGF family of signal molecules is its high neoangiogenetic potential. As imbalances can cause severe complication, the application of systemic but also local anti-VEGF agents has to be well considered and monitored. Systemic application has been found to be effective in several types of neoplasms. Occurring side-effects are often unavoidable and dose-dependent. A local and very effective anti-VEGF therapy is the intravitreal application of anti- angiogenetic agents mainly used to treat the wet form of age-related macular degeneration (wet AMD). In this approach, the abnormal growth of new blood vessels in the retina is inhibited, thus arresting or even reversing patients ́ vision loss. Presently, three different anti-VEGF agents (bevacizumab, ranibizumab and aflibercept) are successfully applied worldwide, but they might differ in their risks to cause side-effects due to their molecular design. As comparing the effects of the two molecularly different drugs on the kidney was one of the major aims of this study, only monkeys have been found to be suitable as study objects because the interactions between the Fc domain of antibodies and the Fc receptors are comparable to those in humans. The fully human, recombinant fusion protein aflibercept (which contains the Fc region of human IgG1) and ranibizumab (a Fc- domain- free antibody fragment) were compared especially regarding kidney tissues in comparison to ocular tissues like the retina/ choroid complex and ciliary body and iris. Also, previous studies had revealed that the interactions of these two anti-VEGF drugs with the retina and choroid clearly differ. Ten cynomolgus monkeys were intravitreally injected either with ranibizumab or aflibercept and ophthalmological examinations were performed. Animals were sacrificed on days one or seven, respectively and eyes and kidneys were removed. One untreated and one monkey treated with aflibercept ́s vehicle served as controls. Light and transmission electron microscopic as well as immunohistochemical and fluorescent microscopical studies were performed. Moreover, measurements of VEGF-plasma levels were performed but all doses were below the detectable limit of the assay. Using a systematic uniform random sampling protocol in TEM, the numbers of fenestrations per μm in glomerular capillaries were estimated and statistically analyzed. Both the anti-VEGF drugs ranibizumab and aflibercept could be detected in kidney glomeruli by immunohistochemistry. No histological pathologies were found in any of the kidneys. Aflibercept significantly reduced VEGF levels in the kidney one and seven days after intravitreal injection- an effect that was not observed in ranibizumab samples. Also, an effect on the number of fenestrations of glomerular endothelial cells was found. Surprisingly, the number of fenestrations of the glomerular endothelium was significantly increased the first day after aflibercept-treatment compared to control and all other samples. Concerning the two time points (one and seven days after injection), a trend of a decrease in the number of fenestrations was seen after treatment with both drugs which was only significant for aflibercept. The significance and cause of the higher number of fenestrations one day after aflibercept injection remains unclear. Stress-related mechanisms as a reaction of the endothelium to possible damage or specific interactions between the drug and kidney tissues as well as the formation of immune complexes should be further examined. Comparing the obtained results to the quantification of fenestrations of the ciliary body ́s vessels, a reduction of fenestrations was found in all samples with aflibercept reducing significantly more fenestrations than ranibizumab. Interestingly, in all eyes treated with aflibercept, vacuoles were found in the pigmented epithelium of the iris for which no rationale was found. It can only be speculated that these vacuoles are congruent with described microcysts of the pigmented iris epithelium or accumulations of glycogen in diabetic patients. Equally, further investigations are needed to estimate if an apparently higher effectiveness in eliminating fenestrations as seen with aflibercept is desirable for example in the treatment of neovascular glaucoma. In conclusion, the possibility of side-effects occurring after a single intravitreal injection of anti-VEGF drugs not only locally in the eye but also in the kidney and other distant organs has to be considered as the drugs were detected in the kidneys and as aflibercept reduced VEGF levels in glomeruli. The mechanisms and impacts of the detected increase of glomerular endothelial cell fenestrations by aflibercept one day after injection need to be further evaluated. Similarly, a possible effect in the sense of a reduction of VEGF-dependent fenestrations of glomerular capillaries in the course of time and after repeated injections requires further studies. Possible effects on the kidney might be more critical for patients with a prior history of nephrological disease and with repeated intravitreal injections as clinically practiced for the treatment of wet AMD. The observed effects in the kidney as well as in ocular tissues and potential differences between ranibizumab and the relatively new aflibercept as well as their possible impacts need to be further examined.

Fenestrierte Kapillaren finden sich in Geweben, in denen Filtration durch eine selektive Barriere realisiert werden muss. Dies ist beispielsweise im Auge der Fall, wo avaskuläre Gewebe ernährt werden müssen. Die fenestrierten Kapillaren der Choriocapillaris der Retina stellen die Blut-Retina-Schranke dar und im Ziliarkörper müssen Kammerwasser und Blut getrennt werden. In der Niere wird die Filtration von Primärharn durch die Blut-Harn-Schranke mit Hilfe der glomerulären Kapillarwand realisiert. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass hierfür spezialisiertes fenestriertes Endothel notwendig ist und dass dieser Phänotyp stark von VEGF (englisch für vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor) abhängig ist. Eine der Hauptfunktionen der Familie der VEGF Signalmoleküle ist ihr hohes Potential, das Wachstum neuer Blutgefäße- die sogenannte (Neo-) Angiogenese- zu fördern. Da jegliche Dysregulation schwere Komplikationen nach sich ziehen kann, sollte die Anwendung systemischer aber auch lokaler Angiogenesehemmer wohl durchdacht und überwacht werden. In einer Vielzahl von Neoplasmen hat sich die systemische Anti-Angiogenesetherapie als effektiv gezeigt. Das Auftreten von Nebenwirkungen in Organen wie zum Beispiel Darm und Niere ist oft unvermeidbar und abhängig von der applizierten Dosis. Eine lokale und sehr effektive Therapie vor allem der feuchten altersbedingten Makuladegeneration stellt die intravitreale Applikation solcher Medikamente dar, bei der das überschießende Wachstum neuer Blutgefäße in der Retina gehemmt wird. Momentan werden weltweit drei verschiedene Medikamente in der Therapie dieser Erkrankung eingesetzt, zwischen denen Unterschiede bezüglich des Risikos der Auslösung von unerwünschten Wirkungen bestehen, die vermutlich in deren unterschiedlichem molekularen Design und der Interaktion mit den betroffenen Geweben sowie dem Immunsystem des Patienten begründet sind. Hierbei scheint vor allem das Vorhandensein einer Fc Domäne von Bedeutung zu sein. Deshalb wurden in dieser Studie Affen als Studienobjekte gewählt, da nur so die spezifisch Interaktionen der Medikamente mit menschlichen Fc-Rezeptoren imitiert werden können. Das erste Ziel der Untersuchungen war es, herauszufinden ob eine einzige intravitreale Injektion der beiden zu vergleichenden Medikamente möglicherweise systemische Nebenwirkungen hervorrufen kann. Des Weiteren interessierte der Vergleich der Wirkungen des vollständig humanen rekombinanten Fusionsprotein Aflibercept (das die Fc Domäne von humanem IgG1 enthält) und Ranibizumab (ein Antikörper-Fragment ohne Fc Domäne) vor allem in Bezug auf ihre Wirkung auf Nierenglomeruli und der Vergleich zu okularen Geweben wie dem Retina-Choroid- Komplex sowie Ziliarkörper und Iris nach einer einzigen intravitrealen Applikation. Hierzu wurden zehn Affen der Gattung Macaca entweder Ranibizumab oder Aflibercept injiziert. Ophthalmologische Untersuchungen wurden durchgeführt und die Tiere ein bzw. sieben Tage nach der Behandlung geopfert, wonach Augen und Nieren entnommen wurden. Ein unbehandelter Affe und ein Tier, dem die Trägersubstanz von Aflibercepts Injektionslösung injiziert wurden, dienten als Kontrollen. Licht- und transelektronenmikroskopische sowie fluoreszenzmikroskopische und immunhistologische Untersuchungen der Nieren ebenso wie eine Bestimmung der VEGF Level im Plasma wurden durchgeführt. In der Tat konnten beide Medikamente durch immunhistochemische Methoden in den untersuchten Nierenglomeruli nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu Ranibizumab reduzierte Aflibercept die VEGF Level in den Nieren einen sowie sieben Tage nach intravitrealer Injektion signifikant. Außerdem zeigte sich ein Effekt auf die Anzahl der Fenestrierungen des glomerulären Endothels. Überraschenderweise nahm die Anzahl der Fenestrierungen des glomerulären Endothels am ersten Tag nach der Injektion von Aflibercept im Vergleich zu Kontrollen und Proben aller anderen Affen stark signifikant zu. Die Unterschiede zwischen den anderen Proben waren weniger deutlich. Bezüglich der beiden Zeitpunkte (ein und sieben Tage nach Injektion) zeigte sich vor allem für die mit Aflibercept behandelten Affen eine Abnahme der Fenestrierungen, die als Tendenz auch in der Ranibizumab-Gruppe zu sehen war. Histologisch zeigten keine der Nieren pathologische Auffälligkeiten. Gemäß früheren Untersuchungen der Retina, wäre eine Verringerung der Anzahl der Fenestrierungen durch antiangiogenetische Behandling auch in der Niere mit ihrem vergleichbaren Phänotyp erwartet worden. Bedeutung und Ursache der Zunahme an Fenestrierungen einen Tag nach der Injektion von Aflibercept bleibt unklar. Stressbedingte Mechanismen wie zum Beispiel eine Reaktion des Endothels auf mögliche Schädigungen oder spezifische Interaktionen des Medikaments mit Nierengewebe sowie die Bildung von Immunkomplexen sollten untersucht werden. Die fenestrierten Kapillaren des Ziliarkörpers tragen auch zur Aufrechterhaltung des intraokularen Drucks bei. Auch bei der Quatifizierung dieser Fenestrierungen wurde eine Reduzierung der Anzahl in allen Proben gefunden, wobei der Effekt von Aflibercept sowohl einen als auch sieben Tage nach Injektion im Vergleich zu Ranibizumab signifikant höher war. Interessanterweise wurden in der Iris aller mit Aflibercept behandelter Tiere Vakuolen gefunden. Es wurde bisher noch keine abschließende Erklärung für deren Auftreten gefunden und die scheinbar höhere Effektivität von Aflibercept muss hier noch weiter untersucht und bewertet werden. Zusammenfassend sollte beachtet werden, dass Nebenwirkungen nach intravitrealer Injektion von antiangiogenetischen Medikamenten nicht nur lokal im Auge, sondern auch in der Niere und anderen entfernten Organen auftreten können. Hinweise hierfür liefert diese Studie, da die Medikamente in allen untersuchten Nieren nachgewiesen wurden und da Aflibercept das VEGF Level in den untersuchten Glomeruli schon nach einer einzigen Injektion reduzierte. Mechanismen und Auswirkungen der erhöhten Anzahl an Fenestrierungen im Endothel der glomerulären Kapillaren einen Tag nach Aflibercept-Injektion sollten weiter untersucht werden. Ebenso muss ein möglicher Effekt im Sinne einer Reduktion der VEGF-abhängigen Fenestrierung der Nierenkapillaren im Laufe der Zeit und nach wiederholten Injektionen näher untersucht werden. Mögliche die Niere betreffende Effekte wären wahrscheinlich für Patienten mit nephrologischen Vorerkrankungen sowie bei wiederholter intravitrealer Injektion, wie es klinisch in der Behandlung der feuchten altersbedingten Makuladegeneration die Regel ist, kritischer.