Dissertation ist gesperrt bis 08.03.2026 !
Synthetische Oligonukleotide als pharmazeutische Wirkstoffe sind auf dem Vormarsch und haben sich als praktikabler therapeutischer Ansatz zur Modulation der Genexpression erwiesen. Zu dieser Familie synthetischer Nukleinsäuren gehören Antisense-Oligonukleotide (ASO), die in der Regel 12 bis 30 Nukleotide lang sind, sowie chemische Phosphorothioate, Aptamere und RNA-Interferenz-Oligonukleotide (RNAi). In Anbetracht der zahlreichen klinischen Versuche ist in Zukunft mit einem weiteren Wachstum von Therapeutika dieser Art zu rechnen. Für pharmazeutische Anwendungen und klinische Versuche müssen die Produkte von hoher Reinheit sein. In den Rohprodukten synthetischer Oligonukleotide finden sich jedoch häufig viele verschiedene Formen von Oligonukleotid-Verunreinigungen mit verkürzten oder verlängerten Basensequenzen (N-1, N-2), Basenmodifikationen (Depurinierung, Desaminierung) und unvollständiger Abspaltung von Schutzgruppen. Daher sind für die Qualitätskontrolle bei der Entwicklung und Herstellung von solchen pharmazeutischen Oligonukleotiden geeignete Reinigung- und Testmethoden erforderlich. Im Falle der Flüssigkeitschromatographie (LC) ist die Ionenpaar-Umkehr- Flüssigkeitschromatographie (IP-RPLC) die bewährte Methode, welche seit Jahrzehnten sehr häufig eingesetzt wird. Die Verwendung hochkonzentrierter Ionenpaar-Reagenzien wie beispielweise Triethylammoniumacetat verursacht jedoch eine starke Ionenunterdrückung bei der Strukturanalyse von Oligonukleotiden mittels Massenspektrometrie (MS), was zu einer reduzierten Nachweisgrenze führt. Gleichzeitig ist die Selektivität der IP-RP für Oligonukleotide als komplexe Biomakromoleküle oft nicht ausreichend oder unbefriedigend. Daher ist es sinnvoll, alternative, idealerweise ionenpaarfreie LC-Methoden zu finden, die Selektivität für strukturell ähnliche Oligonukleotide bieten, was den Schwerpunkt dieser Dissertation
darstellt. Es werden interessante ionenpaar-freie Anwendungen mit unkonventionellen stationären Phasen auf der Basis von Cholesterin oder Polybutylen-Terephthalat diskutiert. Die hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie (HILIC) als vielversprechende Alternative für polare Analyten wurde ebenfalls eingesetzt, um ein detailliertes Verunreinigungsprofil für siRNA unter Verwendung von Ammoniumacetat als Additiv für die mobile Phase zu generieren. Neben der eindimensionalen LC wurden auch mehrere zweidimensionale (2D-LC) Lösungen entwickelt. Mit der 2D-LC wurde eine allgemeine Plattform-Methode entworfen, die eine freie Wahl beliebiger Chromatographie in der ersten Dimension erlaubt. Problematische Komponente wie beispielweise Phosphate oder Ionen-Paar-Reagenzien, die in den mobilen Phasen aus der 1. Dimension enthalten sind, konnten in der zweiten Dimension auf einer C18-Phase unter dem Ausschluss von Ionen-Paar-Reagenzien entfernt werden, um eine Kontamination des MS-Systems zu vermeiden. In einer anderen Studie wurde die Orthogonalität zwischen verschiedenen Chromatographie-Methoden für siRNA-Oligonukleotide in einem potentiellen 2D-LC-Setup untersucht. Anschließend wurde die "beste Übereinstimmung" für ein 2D-LC-Experiment kombiniert, was zu einer höheren Auflösung führte. Schließlich wurde die 2D-LC auch für diastereoselektive Trennungen von Phosphorothioaten verwendet. Dabei wird eines der Sauerstoffatome am Phosphatgerüst gegen Schwefel ausgetauscht, wodurch ein chirales Zentrum entsteht. Die Kombination von einer Amylose-basierten, chiralen Säule mit einer C18 Phase in einer 2D-LC Anordnung ermöglicht eine stark erweiterte Diastereoselektivität, die mit eindimensionalen Trennungen nicht erreicht werden kann.
Hyphenated Technique