Characterization of the architecture of BAK apoptotic foci and mitochondria-ER membrane contact sites

Abstract

Diese Arbeit behandelt die Untersuchung der mitochondriellen Veränderungen, welche während der Apoptose auftreten, in zwei sich ergänzenden Projekten: (I) Das erste Projekt ist der Untersuchung des Mechanismus der Bildung von BAK und BAX Oligomeren während der Apoptose gewidmet. (II) Das zweite Projekt befasst sich mit der Entwicklung eines neuen BRET Biosensors namens MERLIN, welcher die Nahe zwischen Mitochondrien und dem ER an den Mitochondrien-ER Membran Kontaktstellen (MERCs) erspüren kann, die während der Apoptose verändert werden. (I) BAK und BAX sind Schlüsselregulatoren des intrinsischen Apoptose Signalwegs. Sie führen den entscheidenden Schritt der intrinsischen Apoptose, die Permeabilisierung der mitochondriellen Außenmembran durch. Nach einem Apoptose Stimulus, akkumulieren und oligomerisiern BAK und BAX auf der mitochondriellen Außenmembran und formen Poren in der Membran. Dieser Prozess der Akkumulierung und Porenbildung ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Die Ziele dieser Arbeit sind daher, (a) die Strukturen der BAK Akkumulierungen zu charakterisieren, (b) die Kinetik der BAK Akkumulierungen zu untersuchen, (c) den Einfluss von BAX auf BAK Akkumulierungen zu studieren und (d) herauszufinden welche funktionellen Konsequenzen die Unterschiede in der Kinetik und in dem Akkumulierungsmechanismus zwischen BAK und BAX bewirken. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass BAK klar abzugrenzende Strukturen bildet, beispielsweise Ringe, Halbringe und Linien. Diese Strukturen sind von der Form her denen von BAX ähnlich. Sie sind jedoch kleiner und einheitlicher in ihrer Größe. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass sich die Verteilung der BAK Akkumulierungen während dem Voranschreiten der Apoptose geringfügig verändert, von mehr Linien hinzu mehr Ringen. Die zwei Effektoren BAK und BAX beeinflussen sich gegenseitig, wenn sie gemeinsam akkumulieren. Das Vorhandensein von endogenem BAX in BAK Akkumulierungen lässt deren Größe leicht anwachsen. Die schnellere Akkumulierungskinetik von BAK aufgrund seiner mitochondriellen Lokalisierung verursacht einen funktionellen Unterschied zwischen BAK und BAX, in dem sie zu einer früheren Freisetzung der mtDNA führt. (II) Die MERCs sind klar abgrenzbare Subdomänen des ER, welche einen sehr geringen Abstand zu den Mitochondrien aufweisen. Sie sind an vielen wichtigen Zellfunktionen beteiligt, unter anderem der Kalzium-Homöostase, der Synthese und dem Transport von Lipiden, der mitochondriellen Morphologie und es wurde zudem gezeigt, dass sie eine Rolle bei der Regulierung der Apoptose spielen. Die molekulare Zusammensetzung und die Dynamik dieser Strukturen sind daher Gegenstand aktiver Forschung und es ist deshalb notwendig neue Werkzeuge für ihre Erforschung zu entwickeln. In dieser Arbeit haben wir einen auf Nähe zwischen den zwei Organellen basierenden BRET Biosensor namens MERLIN entwickelt. MERLIN ermöglicht es uns dynamische Vorgänge an den Kontaktstellen zu untersuchen. Zuerst haben wir MERLIN systematisch getestet, optimiert und seine Funktionsfähigkeit bestätigt. Wir haben gezeigt, dass die MERLIN Konstrukte richtig lokalisiert sind und, dass sie einen zu vernachlässigenden Einfluss auf Zellvitalität und MERCs haben. Des Weiteren haben wir seine Funktionsfähigkeit bestätigt, indem wir demonstriert haben, dass MERLIN sensitiv genug ist, um Veränderungen in MERCs zu erspüren, welche wir durch MERCs beeinflussende Stoffe und Überexpression beziehungsweise gesenkter Expression eines MERCs Verbindungsproteins namens PDZD8 verursacht haben. Der größte Vorteil von MERLIN gegenüber anderen vorhandenen Biosensoren ist, dass MERLIN ausschließlich Nähe erspürt, und daher keine künstliche physikalische Kontakte zwischen den zwei Organellen herstellen muss. Dies ermöglicht MERLIN dynamische und umkehrbare Prozesse der MERCs zu detektieren. Indem wir Zellen für eine kurze Zeit mit MERCs Stressoren behandelt haben und währenddessen und danach Veränderungen in den MERCs gemessen haben, konnten wir diese Fähigkeit von MERLIN demonstrieren. Darüber hinaus ist MERLIN fähig zuverlässig den Anstieg in MERCs während der Apoptose aufzuzeigen.

This thesis focuses on the study of mitochondrial alterations in apoptosis which is covered by two complementary projects: The first part (I) is dedicated to understanding the assembly mechanism of BAK and BAX during apoptosis. The second part (II) addresses the development of a novel proximity-based BRET biosensor for the investigation of mitochondria-ER membrane contact sites (MERCs), which are altered during apoptosis. (I) BAK and BAX are key regulators of the intrinsic apoptosis pathway. They execute the permeabilization of the mitochondrial outer membrane, which is considered the point-of-no-return. Upon apoptotic stimulation, BAK and BAX oligomerize, assemble into foci, and form pores in the mitochondrial outer membrane. However, the assembly and pore formation mechanism are not fully understood. Therefore, the goals of this thesis are, (a) to characterize the apoptotic BAK assemblies, (b) to study the kinetics of BAK assemblies, (c) to investigate the contribution and influence of BAX on BAK assemblies, and (d) to explore the functional consequences of differences of the assembly mechanism and kinetics of BAK and BAX. In this thesis, we have shown that BAK assembles into distinct supramolecular structures including rings, arcs and lines. These structures were similar to the ones formed by BAX, however, smaller and more uniform in size. The distribution of the BAK assemblies slightly changes over time during the progression of apoptosis, from more linear structures towards more rings. Furthermore, the two effectors co-assembled and influenced each other’s supramolecular organization. Presence of endogenous BAX in BAK foci slightly increased their size. Interestingly, BAK pores enabled an earlier release of mtDNA highlighting that the difference in the assembly mechanisms can give rise to functional consequences. (II) MERCs are distinct subdomains of the ER with close apposition to mitochondria. They are involved in many crucial cellular functions including calcium homeostasis, lipid biosynthesis and transport, mitochondrial morphology, and have been shown to play a role in apoptosis regulation. Therefore, the dynamics of these structures and their molecular composition is a matter of active research and novel tools are required for their investigation. In this thesis, we developed the proximity-based BRET biosensor MERLIN that enables the investigation of dynamic processes at the contact sites. We systematically tested, optimized and verified the functionality of MERLIN. We showed the correct localization of the MERLIN constructs and a neglectable effect of MERLIN on cell viability and MERCs. We further validated MERLN by demonstrating its sensitivity to sense changes in MERCs after treatment with drugs known to cause concrete changes in MERCs and after overexpression or knockdown of the MERCs tether PDZD8. The main advantage of MERLIN over other currently available biosensors is that MERLIN relies on proximity-sensing and does not require the formation of artificial physical links between the two organelles and thus allows the study of dynamic and reversible processes. We showed the ability of MERLIN to detect the plasticity of MERCs by transiently treating cells with stressors and following the kinetics of MERCs changes. MERLIN is capable of robustly detecting the increase in MERCS upon apoptosis induction.