Investigation of the Competitive Fitness of Pseudomonas aeruginosa in Interbacterial Competition

Abstract

Bei Pseudomonas aeruginosa (PA) und Arten des Burkholderia cepacia-Komplexes (Bcc) handelt es sich um nahe verwandte Bakterien, welche häufig in diversen natürlichen Habitaten vorkommen, aber ebenso gefürchtete opportunistische Krankheitserreger bei Personen mit strukturellen Lungenerkrankungen wie Cystischer Fibrose (CF) darstellen. Beide Pathogene zeichnen sich durch einen hohen Grad an genetischer Flexibilität und damit verbundener intrinsischer Antibiotikaresistenz sowie leichter Ausbreitung in Gesundheitseinrichtungen aus. Beide Bakterien setzen ihr nadelartiges Typ-VI-Sekretionssystem (T6SS) ein, um toxische Effektoren in konkurrierende Bakterien zu injizieren. Obwohl dieses Sekretionssystem aufgrund seiner Wichtigkeit für Virulenz und Kompetition seit seiner Entdeckung in Jahr 2006 Gegenstand umfassender Forschung war, ist das koplexe Netzwerk seiner Regulation noch nicht vollständig verstanden. Unter den kürzlich beschriebenen Effektoren des T6SS von PA findet sich die Amidase AmpDh3. Da unsere Arbeitsgruppe sich mit der Rolle von AmpDh3 im Zellwand-Recycling von PA und der Induktion der β-Lactamase AmpC beschäftigte, untersuchten wir zudem zunächst die Sekretion von AmpDh3 durch das T6SS von PA näher. Dabei fanden wir heraus, dass AmpDh3, welches zunächst als periplasmatische Zellwandamidase beschrieben worden war, wahrscheinlich im Zytoplasma lokalisiert ist und nicht durch das T6SS sekretiert wird. In PA sind drei distinkte T6SS-Cluster mit verschiedenen Funktionen bekannt. Obwohl viele Signalwege parallel das T6SS von PA regulieren, scheint der gac/rsm-Signalweg eine zentrale Rolle in der Regulation des antibakteriellen H1-T6SS einzunehmen. Da viele Studien zur Aktivität und Toxizität des T6SS durch genetische Mutationen in Genen wie retS und rsmA die Aktivität des T6SS artifiziell erhöhen, etablierten wir einen interbakteriellen Kompetitionsassay, um das T6SS in Kompetition mit Bcc-Spezies zu untersuchen, ohne das T6SS selbst zu überaktivieren. Außerhalb des Risikos des Entstehens möglicher Artefakte aufgrund der Überaktivierung des T6SS kann eine Manipulation des gac/rsm-Systems eine Vielzahl von Zellantworten beeinflussen, welche die kompetitive Fitness von P. aeruginosa in Anwesenheit eines Kompetitorbakteriums beeinträchtigen können. Mittels fluoreszenter PA-Mutanten und nicht-manipulierter Kompetitor-Bakterien konnten wir die Bedeutung einzelner Effektoren sowie die von Effektor-Kombinationen auf die kompetitive Fitness von PA in Gegenwart von Bcc-Spezies untersuchen. Wir fanden heraus, dass das H1-T6SS, aber nicht das H2-T6SS PA dabei hilft, sich gegen Bcc-Stämme durchzusetzen, und dass daran mehrere Effektoren in Zusammenarbeit beteiligt sind. Um weitere Gene zu identifizieren, welche zur kompetitiven Fitness von PA in Gegenwart von Bcc-Spezies beitragen, wandten wir ein transposon-basiertes Kompetitions-Screening an. Wir konnten dadurch die Histidinkinase AmgS als zuvor unbekannten Mitspieler in der Kompetition von PA identifizieren. Wir gehen davon aus, dass AmgS analog zu den zuvor beschriebenen Histidinkinasen RetS und LadS einen weiteren Regulator von GacS darstellen könnte, welcher es PA erlaubt, weitere externe Stimuli in seine Verteidigungsstrategien zu integrieren.

Pseudomonas aeruginosa (PA) and members from the Burkholderia cepacia complex (Bcc) are closely related bacterial species which are abundantly found in natural environments but are also feared opportunistic pathogens infecting the lungs of people with structural lung diseases like cystic fibrosis (CF). Both PA and Bcc show high rates of intrinsic antibiotic resistance and can easily spread within healthcare facilities due to their genetic flexibility. Both employ their syringe-like Type VI Secretion Systems (T6SS) to deliver toxic effector molecules into bacteria competing for the same resources. While this secretion apparatus has been the subject of extensive research ever since its discovery in 2006 because of its impact on both the virulence and competitive fitness of bacteria, the intricate regulatory network behind its activity is not yet fully understood. Among the recently described toxic effectors of the T6SS of PA was the amidase AmpDh3. Because our group was examining the role of AmpDh3 in cell-wall recycling of PA and in the induction of the β-lactamase AmpC, we further investigated the secretion of AmpDh3 via the T6SS of PA. We found that AmpDh3, which had been described as a periplasmic cell-wall amidase, is in fact localized in the cytoplasm of PA, and that it is in fact not secreted via the T6SS. In PA, three distinct T6SS clusters have been identified, all of which fulfill different functions. The H1-T6SS is likely to play a key role in bacterial competition and is known to be regulated by the gac/rsm signaling pathway, among others. Therefore, many studies investigating the activity and toxicity of the T6SS used genetic mutations in genes like retS or rsmA to artificially increase the activity of the T6SS of PA. Since many of the studies investigating the activity and toxicity of the T6SS used genetic mutations in genes like retS or rsmA to artificially increase the activity of the T6SS of PA via the gac/rsm pathway, we established an interbacterial competition assay to investigate the T6SS in competition with Bcc species without over-activating the T6SS. In addition to potentially creating artifacts stemming from T6SS over-activation of the T6SS, manipulating the gac/rsm system is known to regulate a multitude of cell responses which may impact the competitive fitness of P. aeruginosa in the presence of a competitor bacterium. Using fluorescently labelled PA mutants and unmodified competitor bacteria allowed us to investigate the importance of single effectors or combinations of effectors in the competitive fitness of PA in the presence of Bcc species. We found that the H1-T6SS, but not the H2-T6SS, helps PA to out-compete the Bcc strains, and that multiple effectors act in unison to kill prey cells. In an attempt to identify further genes that contribute to the competitive fitness of PA in the presence of Bcc species, we employed a transposon-screening competition assay. We identified the histidine kinase AmgS as a previously unrecognized player in the competition of PA. We speculate that it might act as a regulator of GacS, analogously to the previously described sensor kinases retS and ladS, allowing PA to sense and respond to even more threats from the environment.