Introduction of a new two-phase extraction method covering a broad spectrum of analytes in food and environmental samples and its miniaturization to determine the pesticide body burden of individual invertebrates

Abstract

Für Lebensmittel, Umwelt- und Biota-Proben ist QuEChERS die Extraktionsmethode der Wahl für ein breites Spektrum von Probentypen und Analyten. Jedoch werden sehr polare und geladene Analyten mit dieser Methode kaum extrahiert. Alternative Methoden wie QuPPE hingegen wurden speziell für polare Analyten entwickelt, sind aber für unpolare Analyten nicht anwendbar. Darüber hinaus erschweren die in QuEChERS verwendeten Salze, die eine Phasentrennung zwischen Acetonitril und Wasser herbeiführen, die Handhabung und können bei der folgenden Analyse durch Ablagerungen auf den Analysegeräten Probleme verursachen. In dieser Arbeit habe ich eine salzfreie Extraktionsmethode entwickelt, die Zucker mit sehr hoher Löslichkeit in Wasser verwendet, um eine Phasentrennung in einem Acetonitril-Wasser-System zu bewirken. Während der Entwicklung der Methode wurde ein breites Spektrum an Additiven untersucht, von denen Zucker die stabilsten Phasentrennungen und die höchsten Wiederfindungsraten für einen Modellmix von Analyten mit breiter Polaritätsverteilung erzielten. Die Zugabe von Isopropanol als polares protisches Lösemittel erhöhte die Wiederfindungsraten für polare Analyten, während die Wiederfindungsraten für unpolare Analyten hoch blieben. Mit Hilfe eines Design of Experiment wurden alle Extraktionsparameter gemeinsam optimiert, um die Anzahl der Experimente zu minimieren und ein globales Optimum zu finden. Mit Doppelextraktionen konnten die Wiederfindungsraten für polare Analyten, insbesondere im zweiten Schritt, auf 69 % erhöht werden. Die optimierte Methode wurde auf feste und flüssige Lebensmittel- und Umweltproben angewandt und erzielte für alle Proben ähnliche oder höhere Wiederfindungsraten als die klassische QuEChERS-Methode. Um eine einfache Anpassung der neuen SWIEET-Methode für die Anwendung auf verschiedene analytische Fragestellungen zu ermöglichen, habe ich die physikochemischen Aspekte des Extraktionsverfahrens untersucht. Hohe Phasenverhältnisse für bestimmte Additivkombinationen korrelierten während der Methodenentwicklung mit hohen Wiederfindungsraten und wurden detaillierter untersucht. Die Konzentrationen von Wasser, Isopropanol und Glukose wurden mittels NMR und Karl-Fischer-Titration bestimmt, um die Zusammensetzung der wässrigen und organischen Phasen von SWIEET zu charakterisieren. Der Wassergehalt konnte den Unterschied in der Wiederfindung der Analyten zwischen SWIEET und QuEChERS erklären, nicht jedoch zwischen den beiden organischen SWIEET-Phasen der Doppelextraktion mit deutlichen Unterschieden für polare und unpolare Analyten. Es wurde vermutet, dass dies auf die Bildung von H-Brückenbindungen mit Isopropanol zurückzuführen ist, was ich durch die Bestimmung von solvatochromen Parameter weiter untersucht habe. Aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit war Reichardts Farbstoff in der Lage, signifikante Unterschiede zwischen der Polarität der organischen Phasen von SWIEET und QuEChERS zu detektieren und wir konnten die Parameter unbekannter Mischungen aus Extraktionen mit einer Reihe von Parametern von Mischungen mit bekannter Zusammensetzung vergleichen. Ich konnte nachweisen, dass durch eine Verringerung des Isopropanolgehalts und Erhöhung des Glukosegehalts die Wiederfindungsraten für unpolare Analyten verbessert werden können, und dass durch eine Erhöhung des Isopropanolgehalts polare Analyten besser extrahiert werden. Die finale SWIEET-Methode wurde miniaturisiert und auf die Bestimmung von Carbendazim in adulten Mücken von Chironomus riparius angewandt, die diesem Pestizid in ihrem Larvenstadium ausgesetzt waren. Das Ziel war, das Verhältnis zwischen internen Konzentrationen und Expositionskonzentrationen zu untersuchen. Für die Analyse von kleinen Invertebraten, idealerweise auf der Ebene von Individuen, wurde die SWIEET-Extraktionsmethode so miniaturisiert, dass keine übermäßige Verdünnung stattfand. Bei SWIEET wurde dies im Vergleich zu QuEChERS durch den Verzicht auf Salze erleichtert. Ich konnte die erfolgreiche Miniaturisierung von SWIEET bis zu einem Gesamtvolumen von 0,5 mL, sowie die Anwendung auf die Extraktion von Carbendazim aus Mücken, sogar aus Individuen zeigen. Ich stellte fest, dass starke Matrixeffekte die Analyse dieser Biota-Proben erschwerten. Die Verwendung matrixangepasster Kalibrierungen entsprechend der Anzahl der Mücken in der Probe war entscheidend, um quantitativ präzise Ergebnisse zu erhalten. Ich konnte eine Dosis-Wirkungs-Beziehung für weibliche Mücken aus dem Carbendazim-Expositionsversuch nachweisen und zeigen, dass das Pestizid auch während der Metamorphose erhalten blieb. Zusammenfassend wurde eine neue Extraktionsmethode mit vereinfachtem Handling entwickelt, die eine Automatisierung und Miniaturisierung erleichtert und zugleich das extrahierbare Analytspektrum auf stark polare bis ionischer Substanzen erweitert.

For food, environmental and biota samples, QuEChERS is the extraction method of choice for a wide range of sample types and analytes, but very polar and charged analytes are hardly extracted with this method. Alternative methods like QuPPE on the other hand were developed especially for polar analytes, but are not applicable to nonpolar analytes. Furthermore, the salts used in QuEChERS to induce a phase separation between water and acetonitrile complicate handling and can cause problems in downstream analysis by deposits on the analytical instruments. In this work, I developed a salt-free extraction method, that uses highly soluble sugars to induce a phase separation in an acetonitrile-water system. Method development was done by screening a wide range of additives, from which sugars produced the most stable phase separations and highest recoveries for a model analyte mix with a broad polarity range. The addition of isopropanol as a polar protic solvent increased recoveries for polar analytes while maintaining high recoveries for nonpolar analytes. Using a design of experiment, all extraction parameters were optimized jointly to minimize the number of experiments and find a global optimum. Double extractions were found to further increase recoveries to 69%, for polar analytes especially in the second step. The optimized final method was applied to solid and liquid food and environmental samples and achieved similar or higher recoveries than the QuEChERS method for all samples. To enable an easy adaptation of the new SWIEET method to various analytical tasks, I investigated the physicochemical aspects of the extraction procedure. High phase ratios for certain additive combinations correlated with high recoveries during method development, which I further investigated. Water, isopropanol and glucose concentrations were determined by NMR and Karl Fischer titration to characterize the composition of the aqueous and organic phases of SWIEET. The water content was able to explain the difference in analyte recoveries between SWIEET and QuEChERS, but not between the two SWIEET organic phases of the double extraction with different recoveries for polar and nonpolar analytes. This was hypothesized to be due to the H-bond formation with isopropanol, which I further investigated by the determination of solvatochromic parameters. Due to its high sensitivity, Reichardt’s dye was able to sense significant differences between the polarity of the organic phases of SWIEET and QuEChERS and I was able to compare the parameters of unknown mixtures from extractions to a set of parameters of mixtures with known composition. I demonstrated that by lowering the isopropanol content and increasing the glucose content, recoveries for nonpolar analytes can be improved, and by increasing the isopropanol content, polar analytes are better extracted. The final SWIEET method was miniaturized and applied to the determination of carbendazim in adult midges from Chironomus riparius exposed to this pesticide at their larval life stadium, to investigate the relation of internal concentrations to exposure concentrations. For the analysis of small invertebrates, ideally at the level of individuals, the SWIEET extraction method was miniaturized so that no excessive dilution took place. With SWIEET, this was facilitated compared to QuEChERS, due to omitting salts. I demonstrated the successful miniaturization of SWIEET down to total volumes of 0.5 mL, as well as the application to the extraction of carbendazim from midges down to individuals. I found that strong matrix effects complicated the analysis of these biota samples and conducting matrix-matched calibrations according to the number of midges in the sample was crucial to gain quantitatively reliable results. I was able to show a dose-response curve for female midges from the carbendazim exposure experiment and that the pesticide was kept also during metamorphosis. In summary, a new extraction method with simplified handling was developed, facilitating both automation and miniaturization while broadening the extractable analyte spectrum to highly polar and ionic compounds.