Structural Studies of BK Polyomavirus Receptor Complexes and Bifunctional Cytochrome P450 Enzymes

Abstract

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 07. Oktober 2027 !

Cytochrome P450 enzymes (P450s) are found in all kingdoms of life, including mammals, bacteria, fungi, and plants. They represent key tailoring enzymes in the secondary metabolism of microorganisms, contributing to the biosynthesis of a plethora of diverse pharmacologically active natural products. They catalyze a broad range of chemical reactions, e.g. hydroxylations, epoxidations or aryl-aryl couplings. Due to their superior chemo-, regio- and stereoselectivity, as well as catalytic versatility, P450s are increasingly explored in biotechnology for the large-scale production of small molecule compounds that are challenging to obtain through conventional chemical synthesis. Recently, a new subclass of bifunctional P450s in Streptomyces species has been characterized to catalyze intramolecular couplings of 2,5-diketopiperazine-containing cyclodipeptides (CDPs) and nucleobase transfers onto CDPs. The resulting products represent a new class of secondary metabolites with yet unknown biological and pharmacological functions. In this study, two members of this subclass from different Streptomyces strains, GymB1 and GymB5, were structurally characterized in their ligand-free state. Additionally, a ternary complex structure of GymB5 bound to the CDP cyclo-L-Tyr-L-Tyr (cYY) and the nucleobase hypoxanthine was established. Structure analysis revealed key features of substrate recognition and specificity, including the identification of amino acid residues critical for ligand interaction. Through site-directed mutagenesis, the chemoselectivity of GymB5 was successfully altered, with the enzyme variant exclusively catalyzing the intramolecular cYY coupling, completely switching the wild-type reaction specificity. These findings set the basis for future enzyme engineering efforts to generate novel CDP-nucleobase products. Polyomaviruses (PyVs) are small, non-enveloped dsDNA viruses that infect a broad spectrum of hosts, including fish, birds, and mammals. In immunocompetent individuals, infections are typically asymptomatic and establish latency. Upon immunosuppression, however, certain PyVs can cause devastating disease. In humans, BK polyomavirus (BKPyV) infection may result in polyomavirus-associated nephropathy (PyVAN), potentially leading to graft loss in kidney transplant recipients, whereas JC polyomavirus (JCPyV) is the causative agent of progressive multifocal leukoencephalopathy (PML), an often-fatal demyelinating disorder. Prior to infectious entry of PyVs, cell attachment is mediated by major capsid protein VP1, with 360 monomers forming the capsid of the virus. PyVs predominantly utilize glycans terminating in sialic acids as primary cellular receptors, with differences in VP1 loop regions corresponding to differential glycan recognition. For both JCPyV and BKPyV, multiple genotypes have been described. While for JCPyV, genotypes are classified as either prototypic or neurotropic, in BKPyV, all characterized genotypes have been associated with disease with great variance in geographic distribution. It remains elusive how amino acid substitutions in the four BKPyV genotypes might affect glycan receptor interactions and infectivity. In this work, binding of synthetic glycooligomers to both BKPyV and JCPyV VP1 was assessed using X-ray crystallography, providing the structural basis for the design of novel cell attachment inhibitors utilizing oligosaccharide motifs. Sequence alignments combined with published structural data enabled the identification of genotypic variability within antibody epitopes of BKPyV VP1, thereby establishing a foundation for future investigations into mechanisms of viral immune evasion. To explore differences in glycan receptor engagement of different BKPyV genotypes, the major capsid protein VP1 was recombinantly expressed and purified. Glycan array analyses led to the discovery of novel carbohydrate ligands and revealed distinct glycan-binding profiles across genotypes. High-resolution crystal structures showed, for the first time, interactions between a non-sialylated moiety of the ganglioside receptor GD1b and BKPyV VP1. Comparative structural analysis across genotypes uncovered variations in receptor engagement that correspond to binding affinities. These findings advance our understanding of polyomavirus glycan recognition and highlight genotype-specific differences in receptor utilization.

Cytochrom P450-Enzyme (P450s) sind in nahezu allen Lebensformen verbreitet, z.B. in Säugetieren, Pilzen, Bakterien und Pflanzen. Als modifizierende Enzyme spielen sie eine zentrale Rolle im Sekundärstoffwechsel von Mikroorganismen und sind an der Bildung zahlreicher pharmakologisch relevanter Naturstoffe beteiligt. Sie katalysieren ein breites Spektrum an chemischen Reaktionen, darunter Hydroxylierungen, Epoxidierungen und Aryl-Aryl-Kopplungen. Durch ihre außergewöhnliche Chemo-, Regio- und Stereoselektivität sowie katalytischer Vielfalt, gewinnen P450 zunehmend an Bedeutung für die biotechnologische Industrie, in der sie für die Herstellung niedermolekularer Verbindungen genutzt werde, die durch konventionelle chemische Synthese nur schwer zugänglich sind. Es wurde gezeigt, dass eine neue Klasse von bifunktionalen P450 Enzymen aus Streptomyceten in der Lage ist, sowohl intramolekulare Kopplungsreaktionen von 2,5-Diketopiperazin-haltigen Cycodipeptiden (CDPs) als auch Nukleobasen-Transfere zu katalysieren. Die entstehenden Produkte repräsentieren eine neue Klasse von Sekundärmetaboliten, deren biologische und pharmakologische Funktion noch ungeklärt sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Vertreter dieser Enzymklasse aus verschiedenen Streptomycetenstämmen, GymB1 und GymB5, in ihrer apo Form strukturell charakterisiert. Zusätzlich wurde die ternäre Komplexstruktur von GymB5 mit den Liganden cyclo-L-Tyr-L-Tyr (cYY) und der Nukleobase Hypoxanthin etabliert. Die Analyse dieser Strukturen ermöglicht neue Einblicke in die Substratbindung und -spezifität, sowie die Identifikation zentraler Aminosäurereste, die an der Substratbindung beteiligt sind. Durch gezielte Mutagenese wurde die Chemoselektivität des Enzyms so verändert, dass die neue Variante ausschließlich die Bildung der intramolekularen Kopplung katalysiert, während die Wildtypreaktion vollständig umgeschaltet wurde. Diese Ergebnisse liefern die Grundlage für die Modellierung zukünftiger Enzyme, die zur gezielten Synthese neuartiger CDP-Nukleobasen genutzt werden können. Polyomaviren (PyVs) sind kleine, unbehüllte, doppelsträngige DNA-Viren, die ein breites Spektrum an Wirten infizieren, unter anderem Fische, Vögel, und Säugetiere. Infektionen verlaufen typischerweise asymptomatisch bei immunkompetenten Individuen und persistieren im Körper. In immunsupprimierten Patienten können bestimmte PyVs allerdings schwere Krankheitsbilder hervorrufen. Bei Nierentransplantationspatienten kann eine Infektion mit dem BK-Polyomavirus (BKPyV) zu einer Polyomavirus-assoziierten Nephropathie (PyVAN) führen, die einen Transplantatsverlust zur Folge haben kann. Das JC-Polyomavirus (JCPyV) ist hingegen der Erreger der progressiven multifokalen Leukoenzephalopathie (PML), einer häufig tödlich verlaufenden demyelinisierenden Erkrankung. Vor dem Eintritt in die Wirtszelle wird die Anheftung von PyVs durch das Hauptkapsidprotein VP1 vermittelt, das mit 360 Monomeren das Kapsid bildet. Als primäre zelluläre Rezeptoren nutzen PyVs überwiegend Glykane mit terminalen Sialinsäuren, wobei Unterschiede in den oberflächenexponierten Loop Regionen mit der Erkennung spezifischer Glykanstrukturen korreliert. Sowohl für JCPyV als auch für BKPyV wurden mehrere Genotypen beschrieben. Während JCPyV-Genotypen in prototypische und neurotrope Varianten unterteilt werden, sind beim BKPyV alle bislang charakterisierten Genotypen mit Erkrankungen assoziiert und zeigen eine ausgeprägte geographische Variabilität in ihrer Verbreitung. Bislang ist jedoch unklar, inwieweit Aminosäuresubstitutionen in den vier Genotypen von BKPyV die Interaktion mit Glykanrezeptoren sowie die Infektiösität beeinflussen. In dieser Arbeit wurde die Bindung synthetischer Glykooligomere an die VP1 Proteine von BKPyV und JCPyV mittels Röntgenkristallographie untersucht, wodurch eine strukturelle Grundlage für die Entwicklung neuartiger Zellbindungsinhibitoren auf Basis von Oligosaccharidmotiven geschaffen wurde. Durch Kombination von Sequenzüberlagerung mit publizierten Strukturen konnte eine genotypische Variabilität innerhalb von Antikörper-Epitopen von BKPyV VP1 identifiziert werden, die ein Basis für weiterführende Untersuchungen zu Mechanismen zur Umgehung der Immunabwehr des Virus liefert. Zur Analyse der glykanvermittelten Rezeptorbindung unterschiedlicher Genotypen wurde VP1 rekombinant exprimiert und aufgereinigt. Glykanarray Analysen führten zur Identifikation neuartiger Kohlenhydratliganden und enthüllten genotypspezifische Unterschiede in der Glykan-Erkennung. Hochaufgelöste Kristallstrukturen offenbarten erstmals Interaktionen zwischen einem nicht-sialylierten Teil des Gangliosidrezeptors GD1b und VP1 von BKPyV. Vergleichende Strukturanalysen der verschiedenen Genotypen zeigten Variationen in der Rezeptorbindung, die mit unterschiedlichen Affinitäten korrelieren. Diese Ergebnisse erweitern das Verständnis der Glykanerkennung durch PyVs und unterstreichen genotypische Unterschiede in der Rezeptornutzung.