ATR1 effectors versus RPP1 receptors: From natural variation to functional diversity

Abstract

Die Fähigkeit, sich schnell an abiotische und biotische Veränderungen anzupassen, ist für Pflanzen und ihr Mikrobiom aufgrund ihrer sessilen Natur unerlässlich. Pflanzen beherbergen zwar viele verschiedene Bakterienstämme, tragen aber auch viele andere Organismen in sich, wie z. B. Pilze, Viren und Oomyceten. Einige von ihnen können für ihren Wirt schädlich sein, wie Oomyceten (Kamoun et al., 2014). Es wurde berichtet, dass sie drastische Ausbrüche bei Kulturpflanzen verursachen, z. B. bei dem Oomyceten Phytophthora infestans, der für die verheerende Kraut- und Knollenfäule von Tomaten und Kartoffeln verantwortlich ist (Dong & Zhou 2022). Um solche drastischen Ausbrüche zu verhindern, ist zunächst das Verstehen der engen Beziehung zwischen Erreger und Wirt erforderlich. Ein gutes Modellsystem, um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, sind Hyaloperonospora arabidopsidis – Arabidopsidis thaliana. Der Oomycete H. arabidopsidis ist ein obligater biotroph, der hochspezifisch für A. thaliana und ist nicht in der Lage ist, andere Wirte zu besiedeln (Coates & Beynon 2010). Wie andere Krankheitserreger sekretieren H. arabidopsidis sogenannte Effektoren in die Pflanze, Proteine, die das pflanzliche Immunnetzwerk manipulieren können. Die Pflanze hat wiederum Mechanismen entwickelt, um intrazelluläre Rezeptoren einzusetzen, um invasiven Effektoren zuerkennen und die Immunantwort zu aktivieren. Diese Interaktion zwischen Erregereffektoren und Wirtsrezeptoren ist entscheidend für die Koevolution zwischen beiden Organismen. Die Sequenzen sowohl der Rezeptoren als auch der Effektoren können zwischen verschiedenen A. thaliana-Pflanzen und H. arabidopsidis Isolaten erheblich variieren, da die Interaktion zwischen diesen Proteinen oft von einzelnen Aminosäuresubstitutionen abhängt, die auch die Resistenz des Wirts beeinflussen können. Diese Sequenzen unterliegen einem starken Selektionsdruck, was zu einer hohen Diversität zwischen den Genomen führt. Ein prominentes Beispiel für ein hochvariables Effektor-Rezeptor-Paar im Pathosystem von H. arabidopsidis - A. thaliana ist der Effektor ARABIDOPSIS THALIANA RECOGNIZED 1 (ATR1) und der Rezeptor RESISTANT TO PERONOSPORA PARASITICA 1 (RPP1). Bei der Bindung von ATR1 bildet RPP1 ein Tetramer, das als Resistosom bekannt ist, eine Struktur, die erst im Jahr 2020 durch Kryo-EM aufgelöst wurde (Ma et al., 2020). Die Bedeutung der ATR1/RPP1-Interaktion wurde durch die Induktion der Resistenz von A. thaliana gegen H. arabidopsidis durch stabile Transformation eines RPP1-Allels demonstriert, das das entsprechende ATR1-Allel detektiert (Rehmany et al., 2005). Diese Interaktion ist stark allel-spezifisch. Obwohl die ATR1/RPP1-Interaktion seit mehr als 20 Jahren untersucht wird, sind die öffentlich zugänglichen genetischen Ressourcen auf vier A. thaliana Linien und vier H. arabidopsidis-Isolate beschränkt und reichen nach wie vor nicht aus, um den Einfluss zu verstehen, den die Diversität sowohl auf dem Effektor als auch auf den Rezeptor auf die gemeinsamen Evolutionsprozesse zwischen beiden Organismen hat. Diese Arbeit befasst sich mit der ATR1/RPP1-Koevolution durch systematische Annotation von ATR1 und RPP1 in groß angelegten Sammlungen von über 100 europaweit gesammelten H. arabidopsidis und über 200 global LONG-READ sequenzierten A. thaliana-Genomen. Ich habe die Genlokus Ähnlichkeiten und Unterschiede in RPP1 hervorgehoben, sowie auf funktionaler Ebene ATR1-interagierende RPP1-Rezeptoren vorhergesagt und entsprechend Repräsentanten getestet, durch Ko-Exprimierungen in Tabak. Um die biologische Relevanz des hochdiversifizierten RPP1-Lokus im Zusammenhang mit der Pathogenität von H. arabidopsidis zu verstehen, führte ich genetische Analysen durch und identifizierte mögliche alternative Genregionen zu RPP1, die für Resistenz zu H. arabidopsidis eine große Rolle spielen können, diese befinden sich auf Chromosom 1 und 4. Zudem untersuchte ich eine A. thaliana-Population, in der RPP1 Lokus fehlte, und zeigte, dass RPP1-fehlende Pflanzen höhere Resistenzen gegen H. arabidopsidis aufweisen können. Diese Ergebnisse machen einen bedeutenden Fortschritt in unserem Verständnis der Komplexität dieses Pathosystems aus und werfen ein neues Licht auf einen hochvariablen Lokus RPP1.

The ability to adapt rapidly to changes in their biotic environment is essential for any organism. While plants host many different strains of bacteria, they also carry other organisms, such as viruses and filamentous eukaryotic organisms. Some of these may be pathogenic to their host, including oomycetes, which cause drastic disease outbreaks in many crops (Kamoun et al., 2014). An example is Phytophthora infestans, responsible for devastating late blight on tomato and potato (Dong & Zhou, 2022). To prevent such outbreaks, we must first understand the exact nature of the relationship between pathogen and host. An excellent model for oomycete-plant interactions is the Hyaloperonospora arabidopsidis - Arabidopsis thaliana pathosystem. The oomycete H. arabidopsidis is an obligate biotroph that is highly specific to A. thaliana, being unable to colonize other hosts (Coates & Beynon 2010). Like many other pathogens, H. arabidopsidis transfers so-called effectors into the plant, proteins that can manipulate plant immunity and physiology. The plant has in turn developed mechanisms to deploy intracellular receptors that recognize the effectors and counter the suppression of the immune response. This interaction between pathogen effectors and host receptors is crucial for understanding the co-evolution between both organisms. The sequences of both receptors and effectors can vary significantly among different A. thaliana individuals and H. arabidopsidis isolates, as the interaction between these proteins often hinges on single amino acid substitutions. Both effector and receptor sequences thus are subject to strong selection pressures, resulting in high diversity across genomes. A prominent example of a highly variable effector-receptor pair in the H. arabidopsidis - A. thaliana pathosystem is the effector ARABIDOPSIS THALIANA RECOGNIZED 1 (ATR1) and its receptor RECOGNITION OF PERONOSPORA PARASITICA 1 (RPP1) (Botella et al., 1998). Upon ATR1 binding, RPP1 forms tetramers, now known as resistosomes. Their structure was solved only in 2020, by cryo-EM (Ma et al., 2020). Despite the ATR1/RPP1 interaction having been studied for more than 20 years, only four host RPP1 variants and four H. arabidopsidis ATR1 variants have been characterized in depth, and another 12 ATR1 alleles were identified through population genomics and ecotype screens. This thesis focuses on ATR1/RPP1 co-evolution by systematic annotation of ATR1 and RPP1 alleles in large-scale samples of over 100 European-wide collected H. arabidopsidis strains and over 200 long-read sequenced A. thaliana genomes. I highlight the locus-wide similarities and differences in RPP1. I also predict ATR1-interacting RPP1 receptor variants and test a subset of these by co-expressing them with different ATR1 alleles. To understand the biological relevance of the highly-diverse RPP1 locus, located on chromosome 3, in context with H. arabidopsidis pathogenicity, I perform genetic analyses and identify possible loci for resistance on chromosome 1 and 4. Lastly, I investigate an A. thaliana population lacking the RPP1 locus and show that RPP1-deficient plants do not seem to perform worse in terms of H. arabidopsidis resistance compared to RPP1-containing plants. My results contribute to our understanding of the complexity of this pathosystem and shed new light on the species-wide diversity in the highly variable RPP1 locus of A. thaliana.