Towards the Structural Analysis of Polysialic Acid Binding Proteins

Abstract

Polysialic acid (polySia) is a polymeric glycan made of α2,8-linked sialic acid moieties. It is found as a posttranslational modification on few proteins throughout the human body, but its prevalence is upregulated during embryogenesis and very low in adults. In addition, it is found on the surface of some tumours. Due to its low prevalence in healthy adults, polySia makes a promising target for gene therapy against these tumours. To date, the recognition of polySia is poorly understood and there is only limited structural data. One of the structures is of the human adenovirus 52 (HAdV-52) short fibre knob (SFK), which binds polySia, with a degree of polymerisation (DP) of three or more, at its non-reducing end. Adenoviruses have been previously used for gene therapy and vaccines, making HAdV-52 a promising vector. However, the affinity for polySia is only in the low millimolar range. Lenman et al. found a single point mutant, K349R, with increased affinity for polySia. In this thesis, multiple additional mutants were designed to further increase the affinity towards polySia. Most mutants, including K349R, were structurally characterised in a ligand-bound form. Out of all mutants, only the mutant K349R forms some additional contacts to polySia, thereby pulling it closer to the SFK surface, which explains the increased affinity. To evaluate the effects of the mutations on polySia binding, I also aimed at determining a dissociation constant (KD) with several different methods including surface plasmon resonance spectroscopy, biolayer interferometry and microscale thermophoresis (MST). PolySia is recognised by the sialic acid binding immunoglobulin-like lectins (Siglecs) 11 (human) and E (mouse), which upon binding downregulate the immune system to prevent an autoimmune response. Siglecs are membrane proteins, and their extracellular part contains an N-terminal V-set domain and several C2-set domains. Usually, Siglecs recognise their ligand with their N-terminal V-set domain. Because polySia can form long polymers, it is unclear whether the C2-set domains also take part in binding to polySia. To explore this, different Siglec-E constructs, comprising different numbers of extracellular domains, were designed and an expression and purification protocol was established in this thesis. Even after multiple improvements to the expression and purification protocol, the yields from each purification were low. Siglec-E is a glycoprotein, but the flexible glycosylation of proteins can prevent crystallisation, thus multiple methods to deglycosylate Siglec-E were explored here. Unfortunately, crystallisation trials with several different Siglec-E proteins, and variants thereof, did not yield any protein crystals to date. I encountered the same problems with determining the affinity between polySia and Siglec-E, as for HAdVs-52 SFK, hence, no KD was determined. I could show with saturation transfer difference-nuclear magnetic resonance spectroscopy that Siglec-E binds to polySia DP5.Because Siglec-E has multiple possible ligands beside polySia, MST experiments with other glycans were conducted, and were successful in case of 3’-sialyl Lewis X (3’sLeX). Siglec-E binds to 3’sLeX with low millimolar affinity and the glycosylation on Siglec-E has a drastic positive effect on the affinity. In contrast, the dimerization of Siglec-E and the presence of the second C2-set affects the affinity only slightly. The purification of Siglec-11 and an unliganded structure of the V-set domain was already established. In this thesis, new Siglec-11 V-set crystals were observed. The structure revealed that the putative polySia binding site is blocked by a crystal contact. In addition, the crystal packing was very tight, making Siglec-11 crystals unsuitable for soaking. Therefore, no structure of Siglec-11 with polySia could be obtained. In summary, this thesis highlights the difficulties of characterising glycan-protein interactions, both in structural characterisation as well as affinity determination. Nevertheless, the insights of this thesis provide a starting point for future research.

Dissertation ist gesperrt bis 27. Oktober 2027 !

Polysialinsäure (PolySia) ist ein Zuckerpolymer, das aus α2,8-verknüpften Sialinsäuren besteht. Im menschlichen Körper findet man PolySia als posttranslationale Modifikation von einigen wenigen Proteinen, wobei ihre Expression im Erwachsenenalter sehr gering ist und hauptsächlich während der Embryogenese vorkommt. Zudem wird PolySia auch auf der Oberfläche von einigen Tumoren gefunden. Durch das geringe Vorkommen in gesunden Erwachsenen eignet sich PolySia als Ziel für gentherapeutische Ansätze gegen diese Tumore. Bis heute gibt es nur sehr wenig Informationen darüber wie genau PolySia durch Proteine erkannt wird. Eine der wenigen bekannten Strukturen ist die von dem kurzen Fibre Knob des humanen Adenovirus 52 (HAdV-52), das PolySia, bestehend aus mindestens 3 Sialinsäureeinheiten, am nicht-reduzierenden Ende bindet. Da Adenoviren bereits erfolgreich für gentherapeutische Anwendungen und Impfstoffe eingesetzt wurden, ist der HAdV-52 ein vielversprechender Vektor zur Bekämpfung von PolySia-positiven-Tumoren. Allerdings liegt die Affinität zu PolySia nur im niedrigen millimolaren Bereich. Lenman et al. haben die Punktmutation K349R identifiziert, die die Affinität zu PolySia erhöht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden weitere Punktmutationen entworfen, die die Affinität zu PolySia ebenfalls erhöhen sollen. Von den meisten Mutanten, darunter K349R, wurden Strukturen im Komplex mit PolySia gelöst. Allerdings konnten nur für die K349R-Mutante weitere Interaktionen zwischen dem kurzen Fibre Knob und PolySia gefunden werden. Diese zusätzlichen Interaktionen sorgen dafür, dass PolySia näher an der Oberfläche des Proteins bindet – was die gesteigerte Affinität erklärt. Um die Effekte der Mutationen nicht nur strukturell zu untersuchen wurde versucht, die Dissoziationskonstante (KD) mit verschiedenen Methoden, darunter Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR), Bio-Layer-Interferometrie (BLI) und Microscale Thermophorese (MST), zu ermitteln. PolySia wird unter anderem von den sialinsäurebindenden Immunoglobulin-ähnlichen Lektinen (Siglecs) 11 im Menschen und E in Mäusen erkannt. Die PolySia-Bindung führt zu einer Herunterregulierung des Immunsystems, um autoimmune Reaktionen zu verhindern. Siglecs sind Membranproteine, deren extrazellulärer Teil aus einer N-terminalen V-set Domäne und mehreren C2-set Domänen besteht. Normalerweise erfolgt die Ligandenbindung nur über die V-set Domäne. Da PolySia aber auch sehr lange Polymere bildet, ist unklar ob in diesem Fall auch die C2-Set Domänen an der Bindung beteiligt sind. Daher wurden in dieser Arbeit verschiedene Siglec-E Konstrukte erstellt, die eine unterschiedliche Anzahl an extrazelluläre Domänen enthalten, und ein Expressions- und Reinigungsprotokoll etabliert. Auch nach etlichen Optimierungen blieben die Ausbeuten an Siglec-E pro Reinigung sehr gering. Zudem ist Siglec-E ein Glykoprotein. Da die flexiblen Glykosylierungen die Kristallisation von Siglec-E verhindern können, wurden mehrere Methoden zur Deglykosylierung getestet. Kristallisationsversuche mit unterschiedlichen Siglec-E Proteinen und seinen Varianten führten bislang jedoch zu keinen Kristallen. Die Bestimmung der Dissoziationskonstante zwischen Siglec-E und PolySia blieb auch erfolglos, da die gleichen Probleme wie bei dem kurzen Fibre Knob von HAdV-52 auftraten. Dennoch konnten wir mit Sättigungstransfer-Differenz-Kernspinresonanzspektroskopie (STD-NMR) zumindest die Bindung an polySia, das aus fünf Sialinsäureeinheiten besteht, nachweisen. Da Siglec-E neben PolySia noch weitere Bindungspartner hat, wurden MST-Experimente mit weiteren Zuckern durchgeführt. Dabei wurde herausgefunden, dass Siglec-E an 3’-sialyliertes Lewis X mit einer niedrigen millimolaren Affinität bindet. Zudem haben die Glykosylierungen von Siglec-E einen deutlichen positiven Effekt auf die Affinität, während die Dimerisierung von Siglec-E und die zweite C2-set Domäne die Affinität nur wenig beeinflussen. Für Siglec-11 war bereits ein Reinigungsprotokoll und eine Struktur der V-set Domäne ohne polySia etabliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Kristalle der Siglec-11 V-set Domäne identifiziert. Die Strukturanalyse zeigte, dass die vermutliche PolySia-Bindungsstelle durch einen Kristallkontakt blockiert ist. Zudem war die generelle Kristallpackung sehr dicht, wodurch keine Soaking-Experimente durchgeführt werden konnten. Daher konnte auch in dieser Arbeit keine Komplexstruktur von Siglec-11 mit polySia gefunden werden. Zusammenfassend verdeutlicht diese Arbeit die Herausforderungen bei der strukturellen und biophysikalischen Charakterisierung von Zucker-Protein-Interaktionen. Trotz alledem liefern die hier gewonnenen Erkenntnisse eine fundierte Grundlage für weiterführende Untersuchungen.