Inhaltszusammenfassung:
Proteine sind lebenswichtige Biomoleküle, die in allen Organismen vorhanden sind. Sie unterschei-
den sich in Größe, Form, Struktur und Funktionalität. In vivo sind Proteine normalerweise in Kontakt
mit anderen Biomolekülen in einem natürlich belebten Milieu oder mit Lösungsmittelmolekülen.
In beiden Fällen sind sie in eine wässrige Umgebung eingetaucht, was das Verständnis ihres Ver-
haltens in Lösung in der biologischen, physikalisch-chemischen, klinischen und pharmazeutischen
Forschung unerlässlich macht.
Diese Arbeit konzentriert sich insbesondere auf Blutserumproteine, die grundlegende Körper-
funktionen wie die Immunantwort, den Nährstofftransport und die Regulierung des osmotischen
Drucks erfüllen. Eines der untersuchten Proteine ist Rinderserumalbumin (BSA), ein globuläres Pro-
tein, das für die Regulation des osmotischen Drucks, den Transport von Fettsäuren, Bilirubin, Min-
eralien und Hormonen sowie als Antikoagulans und Antioxidans im Blut verantwortlich ist. BSA ist
ein etabliertes Standardmodell in der Proteinforschung. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt jedoch
auf monoklonalen Antikörpern (mAbs). Antikörper oder Immunglobuline sind die erste Verteidi-
gungslinie von Säugetierorganismen und damit ein grundlegender Bestandteil des Immunsystems.
MAbs sind Proteine, die so konzipiert und hergestellt sind, dass sie an spezifische Ziele binden, um
ein breites Spektrum von Krankheiten wie Krebs, Autoimmunerkrankungen und Virusinfektionen zu
bekämpfen. Die Möglichkeit der Selbstverabreichung motiviert die Formulierung von Produkten für
die Verabreichung von subkutane (SC) Injektion gegenüber anderen Verabreichungswegen. Die phar-
mazeutische Herausforderung besteht darin, hochkonzentrierte Antikörperlösungen zu formulieren,
um eine signifikante therapeutische Wirkung mit einer minimalen Anzahl von Injektionen zu erzielen
und gleichzeitig die Viskosität zu begrenzen und die kolloidal und physikalisch-chemische Stabilität
zu erhalten.
Die Untersuchung hochkonzentrierter mAb-Lösungen ist von entscheidender Bedeutung, um
unerwünschtes Verhalten in der Formulierung zu vermeiden, wie z.B. Aggregation, Phasentrennung
oder hohe Viskosität, die eine schmerzfreie Injektion verhindern. Es ist bekannt, dass die reversible
Selbstassoziation von Proteinen der zugrundeliegende Mechanismus für eine hohe Lösungsviskosität
ist und in der Regel durch elektrostatische oder hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Mono-
meren hervorgerufen wird. Eine Proteinaggregation, die auf molekularer Ebene beginnt, kann irre-
versibel wachsende Domänen bilden und zu einer makroskopischen Phasentrennung führen. Dieser
Phasenübergang wurde von verschiedenen Disziplinen wie Physik, Chemie, Biologie und Ingenieur-
wissenschaften eingehend untersucht. In den letzten Jahren wurde entdeckt, dass Phasentrennung in
Zellen allgegenwärtig ist, eine wichtige Rolle in biologischen Organismen spielt und die Grundlage
für pathologische Fehlfaltungen und Fehlfunktionen von Proteinen ist.
In dieser Arbeit wird die mikroskopische Diffusion von Proteinen in wässrigen Lösungen auf verschiedenen Zeitskalen, aus verschiedenen Blickwinkeln und mit Hilfe von Neutronenstreutech-
niken untersucht. Da Neutronen mit Kernen wechselwirken, sind sie als nicht-störende Sonden für
die Untersuchung von Materie im Allgemeinen besonders geeignet. Kalte Neutronenstreuung eignet
sich für Längen- und Zeitskalen in weichen und biologischen Systemen, wie z.B. Proteinlösungen. In
dieser Arbeit wurde die Selbst- und Kollektivdiffusion einer beispiellosen Reihe pharmazeutisch rele-
vanter mAbs in einem formelähnlichen Puffer für IgG-Proteine untersucht. Der Einfluss von Crowd-
ing, Temperatur und Antikörpervariante wurde beobachtet.
In der ersten Studie wurde die Kurzzeit-Selbstdiffusion von 5 mAbs mit QENS bei verschiede-
nen Proteinkonzentrationen untersucht, um die Auswirkungen des Crowding zu bewerten, die Selb-
stassoziation der Antikörper zu beobachten und den Zusammenhang mit der Viskosität der Lösung
zu untersuchen. Die Messungen wurden bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt, von der
Lagerung im Kühlschrank bis hin zu physiologischen Temperaturen, um die Dissoziation der Cluster
zu beobachten. In der gleichen Studie wurde SANS verwendet, um die strukturellen Eigenschaften
und die Lösungsorganisation der Proben bei relativ hohen Konzentrationen zu untersuchen. Die
Arbeiten wurden auch durch MD-Simulationen ergänzt.
Die zweite vorgestellte Studie konzentriert sich dagegen auf die kollektive Dynamik und die inter-
molekularen Wechselwirkungen einer größeren Anzahl von mAbs. Zu diesem Zweck wurden NSE-,
SANS- und DLS-Experimente bei verschiedenen Konzentrationen und im oben genannten Temper-
aturbereich, jedoch in entgegengesetzter Richtung durchgeführt, um die Selbstassoziation nahezu in
Echtzeit zu verfolgen. Eine Verlangsamung der Diffusion wird für das viskosere mAbs in Lösung
beobachtet, was auf eine stärkere Selbstassoziation, d.h. die Bildung größerer Cluster, hinweist. Der
Mechanismus verstärkt sich bei Lagertemperatur, die für zwei der viskosesten mAbs als UCST wirkt
und zu LLPS führt. SANS und die Berechnung von Antikörper-Normalmoden (NM) halfen ebenfalls
bei der Bewertung der molekularen Flexibilität in den verschiedenen untersuchten Proteinvarianten
und Isotypen.
Die Ergebnisse der Neutronenstreuung wurden durch eine detaillierte rechnerische Analyse der
Sequenzen und die Extraktion nützlicher Parameter zur Vorhersage ihres Lösungsverhaltens ergänzt.
Darüber hinaus wurden verschiedene Labortechniken wie Dialyse, Zentrifugation, UV-Vis-Spektros-
kopie und Viskosimetrie als wesentliche Hilfsmittel zur Probenvorbereitung und biophysikalischen
Charakterisierung eingesetzt.
Die dritte Studie, über die in dieser Arbeit berichtet wird, zielt darauf ab, die Rolle der Kurzzeit-
dynamik, die mit QENS untersucht wird, beim Eintritt in das LLPS-Regime für ein gut bekanntes
Protein-Salz-System, nämlich BSA in Lösung mit verschiedenen Konzentrationen von LaCl 3 , zu klären.
Dieses System zeigt einen umgekehrten Mechanismus in Bezug auf Antikörperproteine, wobei LLPS
durch LCST angetrieben wird. Die bemerkenswerte Beobachtung ist, dass die mikroskopische Umge-
bung im Nanosekundenbereich sehr dynamisch bleibt, auch wenn das LLPS-Regime durchlaufen
wird, d.h. auch wenn sich die Lösung makroskopisch in zwei Phasen teilt, eine proteinreiche und
eine proteinarme.
Zusammenfassend wurde die kurzzeitige Selbst- und Kollektivdiffusion von Proteinen in Lösung
mit verschiedenen neutronenspektroskopischen Techniken untersucht, um ihre Rolle bei der Pro-
teinaggregation und den Phasentrennungsmechanismen zu klären. Im Fall von mAbs haben wir
beobachtet, dass die Selbstassoziation von Proteinen zur Bildung kleiner Oligomere führt, die aus
einer größeren Anzahl von Monomeren bestehen, wenn die Proteine eine höhere Viskosität aufweisen.
Diese Lösungen zeigen auch ein UCSTLLPS-Verhalten. Bei der Untersuchung eines einfacheren
Protein-Salz-Systems mit LCST-LLPS-Verhalten zeigen wir eine Kontinuität der Kurzzeitdynamik beim Eintritt in den Bereich der Phasentrennung trotz makroskopischer Phasentrennung. Obwohl
es noch viele offene Fragen in der Protein- und Formulierungswissenschaft gibt, sind wir fest davon
überzeugt, dass wir eine wichtige Wissenslücke auf diesem Gebiet geschlossen haben und dass un-
sere Ergebnisse als Ausgangspunkt für zukünftige Studien dienen können.
Abstract:
Proteins are biomolecules crucial for life, present in all organisms. They differ in size, shape, struc-
ture and functionality. Proteins in vivo are normally in contact with other biomolecules in a naturally
crowded milieu or with solvent molecules. In both cases they are immersed in an aqueous environ-
ment, which makes the understanding of their behaviour in solution essential in biological, physico-
chemical, clinical and pharmaceutical research.
In particular, this thesis focuses on blood serum proteins, which fulfil fundamental bodily func-
tions such as immune response, nutrient transport, osmotic pressure regulation. One of the proteins
investigated is bovine serum albumin (BSA), a globular protein responsible of regulating osmotic
pressure, transporting fatty acids, bilirubin, minerals and hormones, and functioning as anticoagu-
lant and antioxidant in blood. BSA is a well-established standard model in protein science. Neverthe-
less, the main focus of the thesis is on monoclonal antibodies (mAbs). Antibodies, or immunoglobu-
lins, are the first line of defence of mammal organisms and thus a fundamental part of the immune
system. MAbs are proteins designed and manufactured to bind to specific targets to fight a broad
spectrum of diseases, such as cancers, autoimmune disorders and viral infections. The possibility
of self-administration motivates the formulation of products for subcutaneous (SC) administration
over other delivery routes. The pharmaceutical challenge associated with is to formulate highly con-
centrated antibody solutions to achieve a significant therapeutic effect with a minimum number of
injections, while limiting their viscosity and preserving their colloidal and physico-chemical stability.
The investigation of highly concentrated monoclonal antibody (mAb) solutions is crucial to avoid
unwanted behaviour in the formulation, e.g. aggregation, phase separation or high viscosity, which
do not permit painless injections. It is known that reversible self-association (RSA) of proteins is
the underlying mechanism of high solution viscosity and it is typically driven by electrostatic or
hydrophobic interactions between monomers. Protein aggregation starting at a molecular level can
irreversibly form growing domains and lead to macroscopic phase separation. This phase transition
has been extensively studied by various disciplines, such as physics, chemistry, biology and engineer-
ing. In recent years it was discovered that phase separation is ubiquitous in cells, plays an essential
role in biological organisms and lies behind protein pathological misfolding and malfunctioning.
In this thesis, protein microscopic diffusion in aqueous solutions is addressed at different time
scales, by different points of view and by means of neutron scattering techniques. By interacting with
nuclei, neutrons are non-disruptive probes particularly suited to study the matter in general. Cold
neutron scattering matches length and time scales in soft and biological systems, such as protein
solutions. Concerning immunoglobulin (Ig) proteins, the self- and collective diffusion of an unprece-
dented series of pharmaceutically relevant mAbs in a formulation-like buffer were investigated for
this thesis. The influence of crowding, temperature and antibody variant was monitored.
In the first study, the short-time self-diffusion of 5 mAbs was studied with quasielastic neutron scattering (QENS) at different protein concentrations, to assess the effects of crowding, observe an-
tibody self-association and how those relate to solution viscosity. Measurements were collected at
temperatures varying from fridge-storage to physiological temperature, to monitor cluster dissoci-
ation. In the same study, small angle neutron scattering (SANS) was employed to probe structural
features and solution organization of the samples at a relatively high concentration. The work is also
enriched by molecular dynamics (MD) simulations.
The second study presented focuses instead on the collective dynamics and intermolecular inter-
actions of a larger series of mAbs. To this purpose, neutron spin-echo (NSE), SANS and dynamic
light scattering (DLS) experiments were conducted at different concentrations and in the temperature
range aforementioned, but in the opposite direction, to monitor self-association almost in real-time. A
slowdown in the diffusion is observed in the most viscous mAbs in solution, indicating the presence
of a stronger self-association, i.e. formation of bigger clusters. The mechanism is more enhanced at
storage temperature, which acts as a upper critical solution temperature (UCST) for two of the most
viscous mAbs, leading to liquid-liquid phase separation (LLPS). SANS and computation of antibody
normal modes (NM) also helped in assessing the molecular flexibility in the different protein variants
and isotypes studied.
Neutron scattering results were enriched with a detailed computational analysis of the mAb se-
quences and the extraction of useful parameters to predict their solution behaviour. Moreover, sev-
eral laboratory techniques like dialysis, centrifugation, ultraviolet-visible (UV-Vis) spectroscopy and
viscometry were employed as essential supports for sample preparation and biophysical characteri-
zation.
The third study reported in this work aims to elucidate the role of short-time dynamics studied via
QENS upon entering the LLPS regime for a quite known protein-salt system, that is BSA in solution
with different concentrations of LaCl 3 . This system exhibits a opposite mechanism with respect to
antibody proteins within a similar temperature range, with LLPS being driven by a lower critical
solution temperature (LCST). The remarkable observation is that the microscopic environment in the
nanosecond scale remains highly dynamic, even while crossing the LLPS regime, so even when the
solution macroscopically splits in two phases, a protein-rich one and a protein-poor one.
In conclusion, short-time self- and collective diffusion of proteins in solution was accessed by dif-
ferent neutron spectroscopy techniques in order to elucidate its role in protein aggregation and phase
separation mechanisms. In the case of mAbs, we observed that protein self-association results in the
formation of small oligomers composed by a higher number of monomers for the proteins exhibiting
higher viscosities. Those solutions also display a UCST-LLPS behaviour in the temperature range
studied. By studying a simpler protein-salt system with a LCST-LLPS behaviour, we reveal a conti-
nuity of the short-time dynamics upon entering the phase separation region, despite the macroscopic
phase-splitting. Although a lot of questions in protein and formulation science remain still open, we
strongly believe that we closed an important knowledge gap in this field and that our results can
serve as starting points for future studies.
Antibodies