Expression und Funktion des Na+/K+/2Cl-Kotransporters NKCC1 im Gastrointestinaltrakt von CFTR-Knockout-Mäusen

Abstract

Die Chlorid-Sekretion stellt eine der zentralen physiologischen Funktionen im Rahmen des gastrointestinalen Verdauungsprozesses dar. Bei Aktivierung der intestinalen Chloridsekretion durch cAMP muss auch die basolaterale Aufnahme gesteigert werden um das zelluläre Elektrolytgleichgewicht aufrecht zu halten. Dabei bildet die basolaterale Chlorid-Aufnahme via dem Bumetanid-sensitiven Kotransporter NKCC1 den limitierenden Faktor für die hauptsächlich durch den Chlorid-Kanal CFTR erfolgende apikale Chlorid-Sekretion. Die Chlorid-Sekretion ist am Pathomechanismus verschiedener Erkrankungen wesentlich beteiligt. Bei der zystischen Fibrose liegt ein Defekt des CFTR-Gens vor, der in einer mangelhaften Chlorid-, Natrium- und Wassersekretion in allen exokrinen Drüsen resultiert. Infolgedessen kommt es zur Produktion eines viskösen Sekrets v.a. im Respirations- und Gastrointestinaltrakt der betroffenen Patienten, was zu Obstruktion, Dilatation, Infektion und Funktionsverlust der Organe führt. Neuere Untersuchungen an einer CFTR-defizienten Zellinie des Pankreas ließen aufgrund verminderter Expressionslevel sowie reduzierter funktioneller Aktivität eine defekte Regulation der basolateralen Anionen-Aufnahme-Mechanismen NBC und NKCC1 vermuten. Diese könnten damit einen wesentlichen Teil des schweren Sekretionsdefekts bei der Zystischen Fibrose darstellen. In dieser Arbeit wurden deshalb sowohl die NKCC mRNA Expression als auch die Transporter-Aktivität und deren Regulation durch intrazelluläres cAMP im Gastrointestinaltrakt von CFTR(+/+) und CFTR(-/-) Mäusen untersucht. Zur Bestimmung der NKCC1 Expressionslevel wurde die Methode der semiquantitativen PCR mit 18s rRNA als interne Kontrolle verwendet, die Na+/K+/2Cl--Transportraten wurden fluorometrisch in BCECF-gefärbten Kolonkrypten mittels der NH4+-Puls-Technik gemessen, zur cAMP-abhängigen Stimulation von NKCC1 diente Forskolin. Das mRNA Expressionsniveau von NKCC1 lag in allen untersuchten Organen des Gastrointestinaltrakts bei den CFTR(-/-) Mäusen niedriger als bei ihren gesunden Geschwistern, dieser Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant und verschwand unter Einbezug des zytoskelettalen Proteins Villin. Der Azosemid-sensitive NH4+-Einstrom als Mass für die basale NKCC1-Transporter-Aktivität war in den CFTR(-/-) im Vergleich zu den CFTR(+/+) Kolonkrypten leicht reduziert, Forskolin führte zu einer deutlichen Steigerung der NKCC-Aktivität und zwar sowohl in den CFTR(+/+) als auch (-/-) Krypten. Ein ähnlicher Effekt konnte unter Applikation des K+-Kanal Hemmstoffs 293 B in den Krypten normaler Mäuse gemessen werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine erhaltene cAMP-abhängige Aktivierung der Transportaktivität im Gastrointestinaltrakt der CFTR(-/-) Mäusen hin, und machen damit eine schwere Fehlfunktion und -regulation basolateraler Anionen-Aufnahme-Mechanismen als Teil des Sekretionsdefekts der Zystischen Fibrose im Gastrointestinaltrakt unwahrscheinlich. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine direkte, von Zellvolumen und intrazellulärer Chlorid-Konzentration unabhängige Aktivierung von NKCC im Kolon durch intrazelluläres cAMP hin. Mit der Intaktheit der basolateralen Anionenaufnahmemechanismen als Grundvoraussetzungen für eine mögliche Aktivierung der Anionensekretion über eventuelle alternative Sekretionsmechanismen könnten der Zukunft neue Möglichkeiten bei der Therapie der Zystischen Fibrose eröffnet werden.

Chloride secretion by the gastrointestinal tract is central to its physiological function. When chloride secretion is activated in response to cAMP in intestinal epithelia, basolateral uptake must also increase to maintain electrolyte composition. The importance of basolateral chloride uptake by the bumetanide-sensitive Na+/K+/2Cl- cotransporter NKCC1 lies in the rate-limiting step in the onset of apical choride secretion predominantly mediated by the chloride channel CFTR. Chloride secretion is defective in several diseases. Cystic fibrosis is caused by a mutation of the CFTR gene, resulting in ineffective chloride, sodium and water secretion in all exocrine glands. This leads to production of viscid mucus predominantly in lung and intestine, the patients suffer of obstruction, dilatation, infection and insufficiency of several organs. New experiments in CFTR-deficient and CFTR-transfected pancreatic tumour cells showed reduced expression and functional activity of NBC and NKCC1 which suggested that CFTR may transcriptionally regulate these basolateral anion uptake mechanisms. This hypothetized that the CF-associated dysfunction of basolateral anion uptake mechanisms, rather than the apical CFTR anion conductance, may cause the severe anion secretory defect in pancreatic ducts of many CF patients. In this dissertation NKCC1 mRNA expression, Na+/K+/2Cl--cotransport activity and regulation by cAMP in crypts isolated from CFTR(+/+) and CFTR(-/-) murine proximal colon were therefore investigated. mRNA expression levels were determined my semiquantitative PCR with 18s rRNA as an internal control, transport rates were measured fluorometrically in BCECF-loaded crypts with the NH4+ puls technique, Forskolin was used for cAMP-mediated stimulation of NKCC1 activity. NKCC1 mRNA expression levels were slightly reduced in the gastrointestine of CFTR(-/-) mice compared to their normal littermates, but this difference didn’t reach statistical significance and dissapeared when villin, a cytoskeletal protein, was comprised. Azosemide-sensitive NH4+ influx as a measure for Na+/K+/2Cl--cotransport was lower in CFTR(-/-) than in CFTR(+/+) crypts and increased significantly in CFTR(+/+) and (-/-) crypts upon forskolin stimulation. A similar effect could be demonstrated in crypts of normal mice after application of the K+ channel inhibitor 293B. In conclusion, these results showed preserved activation by cAMP in colonic crypts from CFTR(-/-) mice, ruling out a severe dysfunction of the Na+/K+/2Cl--cotransporter in CF intestine. Furthermore, these studies establish the existence of a direct, cell-volume- and intracellular chloride concentration independent activation of colonic NKCC by an increase in intracellular cAMP. The functioning of basolateral anion uptake mechanisms is essential for an activation of anion secretion via eventual alternative secretion mechanisms. In the future this might open new possibilities for the therapy of cystic fibrosis.