Nutzung von Nukleinsäure-Protein-Wechselwirkungen für die Wirkanalytik von reaktiven Species

Abstract

Reaktive Species wie Superoxid, Stickstoffmonoxid oder Peroxynitrit sind in eine Vielzahl pathophysiologischer Situationen wie z.B. das Reperfusionssyndrom involviert. Besonders hohe Konzentrationen treten auf, wenn das antioxidative Abwehrsystem nicht mehr in der Lage ist, den Radikalanstieg abzufangen. Die biomedizinische Forschung hat sich auf die Mechanismen der Freisetzung dieser Species unter unterschiedlichen Streßbedingungen fokussiert. Aus diesem Grund sind verschiedene analytische Meßmethoden für den Nachweis entwickelt worden. Sensorische Methoden bieten den Vorteil einer räumlich und zeitlich aufgelösten Analyse der Einzelteilchen. Jedoch gibt es beträchtliche Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen reaktiven Species, was die Aussagefähigkeit von Einzelmessungen in komplexen Situationen einschränkt. Hier erscheint ein Summenparameter für die Radikalwirkung im Sinne einer Wirkanalytik aussagekräftiger. Das ‘iron regulatory protein 1’ (IRP1) kann als ein solches Markerprotein betrachtet werden, dessen Konzentration Aufschluß über den zellulären Streßlevel gibt. Das Protein wird unter der Wirkung von oxidativem Streß aus dem 4Fe-4S-Enzym cytosolische Aconitase gebildet. Das entstandene IRP1 zeigt im Gegensatz zur Aconitase eine ausgeprägte Bindungsaffinität zu spezifischen m-RNA-Strukturen - den sogenannten ‘iron responsive elements’ - IREs. Dieses Verhalten kann als Grundlage für die sensorische Detektion des Markerproteins genutzt werden. In dem hier vorzustellenden experimentellen Ansatz wurde die Proteinbindung mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz detektiert. Hierzu wurde eine IRE-Konsensus-Sequenz in vitro transkribiert und anschließend auf einem Carboxydextran–modifizierten Biacore-Chip immobilisiert. Eine relativ hohe Oberflächenbelegung (2000 RU /mm2) wurde sichergestellt.