AAA Proteins and the Origins of Proteasomal Protein Degradation

Abstract

AAA (+) proteins are ATPases associated with diverse cellular activities coupling ATP-hydrolysis to remodelling, disaggregation, and unfolding of a variety of substrates. The central ATPase domain functions as a molecular switch, which receives input from N-terminal substrate recognition domains, and which transfers the output to downstream effectors. AAA+ proteases recognize misfolded proteins with their N-domain, unfold and thread them through the pore of the hexameric ring, and feed them to proteases, either residing on the same polypeptide chain, or being contacted via (C-terminal) interaction motifs. We have investigated the divergent evolution of N-domains of known and putative proteasomal ATPases and their C-terminal interaction motif, which is crucial for the regulation of the proteasome, a self-compartmentalizing protease involved in the degradation of unfolded substrates within a large cylinder-shaped architecture.

The first part comprises three case studies of hypothetical proteins, homologous to double-psi barrel, beta-clam and OB-fold N-domains of AAA proteins. We present the first characterization of a CTP-specific archaeal riboflavin kinase, which is homologous to the double-psi barrel of AAA proteins of the CDC48 group, sharing a duplicated beta-element in their common core. We show that archaeal riboflavin kinases provide an evolutionary bridge between highly symmetric RIFT-barrel transcription factors and ATP-specific bacterial/eukaryotic riboflavin kinases allowing us to describe an evolutionary trajectory from DNA-binding to enzymatic activity. A beta-clam domain, which is found in AAA proteins of the CDC48 and AMA groups, was detected in context of a C-terminal domain lacking significant similarity to known domains. We present the full-length structure of a member of this family, whose C-terminal domain forms a homohexameric twelve-bladed beta-propeller (HP12). Each monomer accommodates two propeller-blades that have retained traces of a duplication event, suggesting that monomeric beta-propellers evolved via oligomeric intermediates. We show that HP12 forms a ternary complex with a genetically coupled endonuclease III and DNA implying a function in base-excision DNA-repair. We identified a protein family in methanogenic archaea that contains an OB-fold, similar to the N-domain of proteasome activating nucleotidases (PAN), and a proteasome-like Ntn-hydrolase domain. Our crystal structure of a member of this family reveals a monomeric proteasome-homolog of methanogens (MPM), which acquired an OB-fold domain, probably functioning as a substrate recognition domain for the protease. The internal symmetry of the six-stranded OB-fold suggests that it evolved by duplication of an ancestral beta-meander. The beta-element of double-psi barrels and riboflavin kinases, the propeller blade of HP12, and the three-stranded beta-meander of the OB-fold of MPM shed light on the evolution of autonomously folding domains through duplication and fusion of ancestral supersecondary structure elements, presumably via oligomeric intermediates.

In the second part, we trace the origins of proteasomal protein degradation. We present a systematic sequence analysis of the C-termini of archaeal AAA proteins uncovering the presence of the proteasome-interaction motif in AAA proteins of the CDC48 and AMA group in addition to known proteasome activating nucleotidases of the PAN group. Furthermore, we detect the absence of PAN proteins in major archaeal lineages supporting our hypothesis that kingdom-wide conserved CDC48 proteins function as regulatory ATPases of the proteasome. The presence of up to five putative proteasomal ATPases in certain archaea prompted us to predict a network of AAA ATPases, which regulates the archaeal proteasome. This network could increase the capabilities of proteasomal protein degradation in archaea through the participation of different N-terminal substrate recognition domains. Analysis of the genetic context of the yet uncharacterized Anbu proteasome homolog revealed a conserved operon structure, widespread in proteobacteria and cyanobacteria. The components of the operon point to a peptide tagging system, remotely resembling ubiquitylation and sampylation, which target substrates for degradation by the proteasome in eukaryotes and archaea. Finally, we describe the global distribution of proteasome-like Ntn-hydrolases and putative proteasomal ATPases on the tree of life. This analysis supports the scenario that actinobacteria acquired the proteasome through lateral gene transfer. Among the large assemblies of proteasome-like Ntn-hydrolases the highly divergent monomeric proteasome-homolog of methanogens (MPM) is an exception, because this derived group has lost its ability to self-compartmentalize. In contrast to proteasome-ATPase complexes, MPM including the OB-fold has evolved from an intricate towards a more simplified molecular phenotype.

AAA (+) Proteine sind ATPasen, die die Energie aus der Hydrolyse von ATP an die Remodellierung Disaggregation und Entfaltung einer Vielfalt von Substraten koppeln. Die zentrale ATPase Domäne funktioniert als molekularer Schalter, der über die Bindung von Substraten an N-terminalen Erkennungsdomänen betätigt wird, und der die remodellierten Substrate an Partnerprotein weiterreicht. Im Fall von AAA+ Proteasen werden fehlgefaltete Proteine durch die N-domäne erkannt, durch die Pore des hexameren ATPase-Rings gefädelt und schließlich von Proteasen wie dem Proteasom zu kleineren Peptiden hydrolysiert. Wir haben die Evolution der N-Domänen von ATPasen, die als Regulator für das Proteasom fungieren (PAN), bzw. fungieren könnten (CDC48 und AMA), untersucht, sowie die C-terminalen Interaktionsmotive dieser ATPasen, die eine wichtige Rolle für die Bindung an das Proteasoms spielen.

Im ersten Teil dieser Arbeit beschreiben wir drei Fallstudien von Proteinen unbekannter Funktion, die sich mit der Evolution von drei dieser N-Domänen, der Double-psi-Barrel-, der beta-Clam- und der OB-Fold-Domäne, beschäftigen. Wir präsentieren die erste Charakterisierung einer CTP-spezifischen archaealen Riboflavinkinase (RFK), die mit dem Double-Psi-Barrel von AAA-Proteinen der CDC48-Gruppe durch ein dupliziertes Peptid verwandt ist. Diese RFKs bilden eine evolutionäre Brücke zwischen ebenfalls verwandten Transkriptionsfaktoren und ATP-spezifischen RFKs, wie sie in Eukaryonten zu finden sind. Wir beschreiben die evolutionären Veränderungen, die nötig waren, um ein DNA-bindendes Protein in ein Enzym zu verwandeln. Eine beta-Clam Domäne, die in AAA-Proteinen wie CDC48 und AMA enthalten ist, wurde im Kontext einer C-terminalen Domäne detektiert, die keine Sequenzähnlichkeit zu bekannten Proteinen aufweist. Wir zeigen die Volllängenstruktur eines Mitglieds dieser Proteinfamilie, deren C-terminale Domäne als homohexamerer beta-Propeller mit 12 Blättern faltet (HP12). Ein Monomer des Propellers besteht aus zwei Blättern, die auf eine Duplikation zurückgeführt werden können, was darauf hinweist, dass dieses Protein ein Intermediat in der Evolution von monomeren beta-Propellern darstellen könnte. Wir zeigen außerdem, dass HP12 einen ternären Komplex mit einer genetisch gekoppelten Endonuklease III und DNA bildet. Daher ist dieses Protein in die Reparatur von DNA involviert. Wir haben eine OB-Fold Domäne, ähnlich derjenigen, die sich am N-terminus von proteasomalen PAN ATPasen befindet, in einer Proteinfamilie detektiert, die zusätzlich eine proteolytische Ntn-hydrolase Domäne enthält, welche wiederum Kernbestandteil des Proteasoms ist. Die Kristallstruktur eines Mitglieds dieser Familie zeigt ein monomers Proteasom-Homolog (MPM), das unserer Vorhersage entsprechend eine OB-fold Domäne am C-terminus enthält. Die interne Symmetrie dieser Domäne und die Repetition eines Sequenzmotivs verweisen auf eine Entstehung durch Duplikation eines dreisträngigen Supersekundärstruktureelements hin. Duplizierte Supersekundärstrukturelemente wie das Peptid der Double-psi Barrel, das Propellerblatt von HP12, sowie der beta-Meander des OB-Fold von MPM unterstützen die Hypothese, dass autonom faltende Domänen durch die Vervielfältigung, Fusion und Rekombination solcher ancestraler Peptide entstanden sind.

Im zweiten Teil untersuchen wir die Ursprünge proteasomaler Proteindegradation. Wir präsentieren eine systematische Sequenzanalyse archaealer AAA-Proteine, die das Vorhandensein des Motivs für die Interaktion mit dem Proteasom in ATPasen der CDC48- und der AMA-Gruppe enthüllt. Da die bekannte Proteasom-aktivierende ATPase PAN in einer Vielzahl archaealer Organismen abwesend ist, schlagen wir vor, dass CDC48 und AMA ebenfalls als Regulatoren des Proteasoms fungieren können. Manche Archaeen besitzen bis zu fünf ATPasen mit dem Interaktionsmotif, weshalb wir die Existenz eines Netzwerks von ATPasen vorhersagen, welches das archaeale Proteasom reguliert. Dieses Netzwerk könnte die Leistungsfähigkeit proteasomaler Degradation erhöhen, da verschiedene N-terminale Substraterkennungsdomänen involviert sind. Zuletzt haben wir die Verteilung von proteasom-ähnlichen Ntn-hydrolasen und proteasomalen ATPasen auf dem Baum des Lebens untersucht. Diese Analyse unterstützt das Szenario, dass Actinobakterien, die einzige Gruppe bakterieller Organismen mit Proteasom, dieses durch lateralen Gentransfer erhalten haben. Die von uns charakterisierte MPM Protease ist ein vom Proteasom abgeleitetes Charakteristikum methanogener Archaeen und stellt eine Ausnahme unter den Proteasom-Homologen dar. Während das Proteasom eine große zylinderförmige Architektur formiert, die einen Komplex mit hexameren ATPasen bildet, ist MPM ein monomer, das eine Substraterkennungsdomäne auf der selben Peptidkette besitzt. Daher dürfte die MPM Protease eine Entwicklung von einem komplizierten zu einem vereinfachten molekularen Phänotyp darstellen.